Formül
eklenecek hacim = flakondaki kütle ÷ hedef derişim
Birimleri eşleştir: mg ÷ mg/mL, mL verir; µg ÷ µg/µL, µL verir.
Örnekler
- 5 mg peptit, 2 mg/mL'ye: 5 ÷ 2 = 2,5 mL.
- 100 µg antikor, 0,5 mg/mL'ye (0,5 µg/µL): 100 ÷ 0,5 = 200 µL.
- 1.500 g/mol'lük bir peptitten 1 mg, 1 mM'ye: 0,001 g ÷ 1.500 g/mol = 0,667 µmol ve 0,667 µmol ÷ 1 mmol/L = 667 µL.
Flakonda gerçekte ne kadar olduğunu kontrol et
Sentetik bir peptidin tozu tamamen peptit değildir. Trifloroasetat gibi karşı iyonlar ve bağlı su çoğu zaman ağırlığın %10 ile %30'unu oluşturur; bu yüzden analiz sertifikasında örneğin %80 net peptit içeriği yazabilir. Hesaplamadan önce brüt kütleyi bu oranla çarp: %80'de 5 mg, 4 mg peptittir. Proteinlerde miktarı veri sayfasından kontrol et ve çözdükten sonra derişimi 280 nm'deki absorbansla doğrula.
Çözücüyü seçmek
- Önce veri sayfasına uy. Çoğu protein ve antikor suyla ya da liyofilize edildikleri tamponla geri çözülür.
- Çok sayıda bazik kalıntı (K, R, H) taşıyan peptitler biraz seyreltik asetik asitte, asidik olanlar (D, E) biraz seyreltik amonyum bikarbonatta daha iyi çözünür.
- Çok hidrofobik peptitler önce az miktarda DMSO, sonra tamponla yavaş seyreltme gerektirebilir. Sistein veya metiyonin içeren peptitlerde DMSO'dan kaçın; onları oksitleyebilir.
Adımlar
- Tozun üzerinde nem yoğuşmasın diye flakonu açmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekle.
- Tozun hepsi dipte toplansın diye kısa bir süre santrifüjle.
- Çözücüyü flakonun duvarından yavaşça ekle.
- Hafifçe çevir veya yuvarla ve 15–30 dakika beklet. Proteinleri vorteksle sertçe çalkalama; denatüre olup köpürebilirler.
- Bulanık kalırsa peptitlerde kısa bir ultrasonik banyo işe yarayabilir. Kalan tanecikler çözünmemiştir: santrifüjle çöktür ve süpernatanın derişimini ölç.
Saklamak
Her dondurup çözme döngüsü aktivite kaybettirebileceği için çözeltiyi tek kullanımlık alikotlara böl ve −20 °C veya −80 °C'de dondur. Yaklaşık 0,1 mg/mL'nin altındaki seyreltik proteinler tüp duvarına yapışır; deneyi etkilemiyorsa %0,1 BSA gibi bir taşıyıcı protein bunu önler.
Hesaplayıcılar
Sulandırma hesaplayıcı, hedef derişim için hacmi ya da bir hacimden derişimi kütle veya molar birimlerle verir. Sonucu kontrol etmek için: Protein derişimi hesaplayıcı (A280). Çalışma seyreltmelerini planlamak için: Stok çözelti hesaplayıcı.