Lyophilisiertes Protein oder Peptid rekonstituieren

Die Formel

zuzugebendes Volumen = Masse im Vial ÷ Zielkonzentration

Achte auf passende Einheiten: mg ÷ mg/mL ergibt mL, µg ÷ µg/µL ergibt µL.

Beispiele

• 5 mg Peptid auf 2 mg/mL: 5 ÷ 2 = 2,5 mL.
• 100 µg Antikörper auf 0,5 mg/mL (0,5 µg/µL): 100 ÷ 0,5 = 200 µL.
• 1 mg eines Peptids mit 1.500 g/mol auf 1 mM: 0,001 g ÷ 1.500 g/mol = 0,667 µmol, und 0,667 µmol ÷ 1 mmol/L = 667 µL.

Prüfe, wie viel wirklich im Vial ist

Das Pulver eines synthetischen Peptids ist nicht nur Peptid. Gegenionen wie Trifluoracetat und gebundenes Wasser machen oft 10 % bis 30 % des Gewichts aus, deshalb nennt das Analysenzertifikat etwa einen Netto-Peptidgehalt von 80 %. Multipliziere die Bruttomasse vor dem Rechnen mit diesem Anteil: 5 mg bei 80 % sind 4 mg Peptid. Bei Proteinen prüfst du die Menge im Datenblatt und bestätigst die Konzentration nach dem Lösen über die Absorption bei 280 nm.

Das Lösungsmittel wählen

• Halte dich zuerst an das Datenblatt. Die meisten Proteine und Antikörper kommen zurück in Wasser oder in den Puffer, aus dem sie gefriergetrocknet wurden.
• Peptide mit vielen basischen Resten (K, R, H) lösen sich besser in etwas verdünnter Essigsäure, saure (D, E) in etwas verdünntem Ammoniumhydrogencarbonat.
• Sehr hydrophobe Peptide brauchen eventuell zuerst ein kleines Volumen DMSO und dann langsames Verdünnen in Puffer. Vermeide DMSO bei Peptiden mit Cystein oder Methionin, die es oxidieren kann.

Schritte

1. Lass das Vial vor dem Öffnen Raumtemperatur annehmen, damit keine Feuchtigkeit auf dem Pulver kondensiert.
2. Zentrifugiere es kurz, damit das ganze Pulver am Boden liegt.
3. Gib das Lösungsmittel langsam an der Wand des Vials hinein.
4. Schwenke oder rolle es sanft und lass es 15 bis 30 Minuten stehen. Vortexe Proteine nicht kräftig, das kann sie denaturieren und aufschäumen.
5. Bleibt es trüb, hilft bei Peptiden kurz das Ultraschallbad. Was dann noch an Partikeln übrig ist, ist nicht gelöst: Zentrifugiere es ab und miss die Konzentration im Überstand.

Lagern

Teile die Lösung in Aliquots für den einmaligen Gebrauch und friere sie bei −20 °C oder −80 °C ein, denn jeder Gefrier-Tau-Zyklus kann Aktivität kosten. Verdünnte Proteine unter etwa 0,1 mg/mL haften an der Gefäßwand. Ein Trägerprotein wie 0,1 % BSA verhindert das, wenn es den Versuch nicht stört.

Rechner

Der Rekonstitutions-Rechner gibt das Volumen für eine Zielkonzentration an, oder die Konzentration aus einem Volumen, in Masse- oder molaren Einheiten. Prüfe das Ergebnis mit Proteinkonzentration berechnen (A280) und plane Arbeitsverdünnungen mit dem Stammlösungs-Rechner.