Формула
объём растворителя = масса во флаконе ÷ нужная концентрация
Следите за единицами: мг ÷ мг/мл дают мл, мкг ÷ мкг/мкл — мкл.
Примеры
- 5 мг пептида до 2 мг/мл: 5 ÷ 2 = 2,5 мл.
- 100 мкг антитела до 0,5 мг/мл (0,5 мкг/мкл): 100 ÷ 0,5 = 200 мкл.
- 1 мг пептида с массой 1500 г/моль до 1 мМ: 0,001 г ÷ 1500 г/моль = 0,667 мкмоль, и 0,667 мкмоль ÷ 1 ммоль/л = 667 мкл.
Проверьте, сколько на самом деле во флаконе
Порошок синтетического пептида — не только пептид. Противоионы, например трифторацетат, и связанная вода часто составляют 10–30 % массы, поэтому в сертификате анализа может стоять, скажем, содержание пептида нетто 80 %. Перед расчётом умножьте массу брутто на эту долю: 5 мг при 80 % — это 4 мг пептида. Для белков сверьте количество с паспортом продукта, а после растворения проверьте концентрацию по поглощению при 280 нм.
Выбор растворителя
- Сначала следуйте паспорту продукта. Большинство белков и антител восстанавливают водой или буфером, из которого их лиофилизировали.
- Пептиды с большим числом основных остатков (K, R, H) лучше растворяются в небольшом количестве разбавленной уксусной кислоты, кислые (D, E) — в разбавленном гидрокарбонате аммония.
- Очень гидрофобным пептидам может понадобиться сначала небольшой объём ДМСО, а затем медленное разбавление буфером. Не используйте ДМСО для пептидов с цистеином или метионином: он может их окислить.
Порядок действий
- Перед вскрытием дайте флакону нагреться до комнатной температуры, чтобы на порошке не конденсировалась влага.
- Кратко центрифугируйте, чтобы весь порошок оказался на дне.
- Медленно добавьте растворитель по стенке флакона.
- Аккуратно покачайте или покатайте флакон и оставьте на 15–30 минут. Не встряхивайте белки на вортексе: они могут денатурировать и вспениться.
- Если раствор остаётся мутным, пептидам может помочь короткая обработка в ультразвуковой ванне. Оставшиеся частицы не растворились: осадите их центрифугированием и измерьте концентрацию надосадочной жидкости.
Хранение
Разлейте раствор на аликвоты для однократного использования и заморозьте при −20 °C или −80 °C: каждый цикл замораживания и оттаивания может снижать активность. Белки в концентрации ниже примерно 0,1 мг/мл прилипают к стенкам пробирки; белок-носитель, например 0,1 % БСА, предотвращает это, если не мешает эксперименту.
Калькуляторы
Калькулятор восстановления даёт объём для нужной концентрации или концентрацию по объёму, в массовых или молярных единицах. Результат можно проверить через Калькулятор концентрации белка (A280), а рабочие разведения поможет спланировать Калькулятор стоковых растворов.