Что нужно
Значения Ct для целевого гена и референсного гена (гена домашнего хозяйства, например GAPDH или ACTB, экспрессия которого не меняется от обработки), измеренные в обработанном и контрольном образцах.
Три шага
- Нормируйте каждый образец на референсный ген: ΔCt = Ct целевого − Ct референсного.
- Сравните обработанный образец с контролем: ΔΔCt = ΔCt обработанного − ΔCt контроля.
- Переведите в кратность изменения: кратность = 2−ΔΔCt.
Разобранный пример
Обработанный: Ct целевого 22,1, Ct референсного 18,0, так что ΔCt = 4,1. Контроль: Ct целевого 24,5, Ct референсного 18,0, так что ΔCt = 6,5.
ΔΔCt = 4,1 − 6,5 = −2,4, и кратность = 22,4 = 5,3. Целевой ген экспрессируется в обработанном образце примерно в 5,3 раза сильнее. Кратность меньше 1 означает более низкую экспрессию; 0,5 — вдвое меньше.
Когда 2^-ΔΔCt недостаточно
Метод предполагает, что обе пары праймеров работают с эффективностью около 100%, удваивая продукт в каждом цикле. Проверьте это по калибровочной кривой; обычный диапазон — 90–110%. Если эффективности различаются, используйте метод Пфаффла, который подставляет в расчёт собственную эффективность каждого гена: отношение = EцелевогоΔCt целевого ÷ EреференсногоΔCt референсного, где каждый ΔCt — контроль минус обработанный, а E = 1 + эффективность.
Повторности и статистика
- Усредняйте технические повторности (лунки одного образца) до расчёта ΔCt.
- Проводите статистику по значениям ΔCt или ΔΔCt биологических повторностей, а не по кратностям, потому что кратность распределена не нормально.
- Указывайте log2 кратности, то есть просто −ΔΔCt, когда хотите видеть повышение и понижение экспрессии в одной шкале.
Калькулятор
Калькулятор ΔΔCt усредняет Ct повторностей, даёт ΔCt, ΔΔCt, кратность и log2 кратности и переходит на метод Пфаффла, когда вы вводите эффективности праймеров. Для абсолютной количественной оценки по калибровочной кривой Калькулятор числа копий ДНК рассчитывает копии в каждом стандарте.