Как рассчитать число копий ДНК

Формула

копии = (масса в нг × 6,022 × 10²³) ÷ (длина в п. н. × 660 × 10⁹)

660 г/моль — средняя масса одной пары оснований двуцепочечной ДНК (около 330 на основание для одноцепочечной ДНК и 340 для РНК), 6,022 × 10²³ — число Авогадро, а 10⁹ переводит нанограммы в граммы. Чем длиннее молекула, тем меньше копий в нанограмме.

Разобранный пример

Сколько молекул в 1 нг плазмиды длиной 5000 п. н.?

1. Молярная масса: 5000 × 660 = 3,3 × 10⁶ г/моль.
2. Моли: 1 × 10⁻⁹ г ÷ 3,3 × 10⁶ г/моль = 3,03 × 10⁻¹⁶ моль.
3. Копии: 3,03 × 10⁻¹⁶ × 6,022 × 10²³ = 1,8 × 10⁸ копий.

Удобное правило: 1 нг фрагмента длиной 1 т. п. н. — это около 9 × 10⁸ копий, а 1 нг длиной 1 п. н. было бы 9 × 10¹¹, так что делите на длину в п. н.

От копий обратно к массе

После преобразования: масса (нг) = копии × длина × 660 × 10⁹ ÷ 6,022 × 10²³. Для 10⁶ копий той же плазмиды это 10⁶ × 5000 × 660 × 10⁹ ÷ 6,022 × 10²³ = 5,5 × 10⁻³ нг, или 5,5 пг.

Стандартная кривая qPCR

Для абсолютной количественной оценки нужны стандарты с известным числом копий. Измерьте концентрацию плазмиды, переведите её в копии на мкл, затем сделайте десятикратные серийные разведения, например от 10⁸ до 10² копий на мкл. Запустите их вместе с образцами; график Ct против логарифма копий должен быть прямой с наклоном около −3,3 (эффективность 100%). Линеаризованная плазмида даёт более точные стандарты, чем суперскрученная, а носитель вроде тРНК или дрожжевой РНК не даёт разведениям с малым числом копий прилипать к стенкам пробирки.

Калькуляторы

Калькулятор числа копий ДНК переводит нанограммы в копии и обратно для ДНК или РНК любой длины. Концентрацию по показанию A260 даст Калькулятор концентрации ДНК; для относительной, а не абсолютной количественной оценки используйте Калькулятор ΔΔCt.