Плотность посева считается на площадь
Адгезивные клетки обычно сеют с плотностью в клетках на см² площади роста, поэтому одна и та же плотность даёт одинаковое покрытие в любой посуде. Типичные площади роста:
- 96-луночный планшет: 0,32 см² на лунку
- 24-луночный планшет: 1,9 см² на лунку
- 12-луночный планшет: 3,8 см² на лунку
- 6-луночный планшет: 9,5 см² на лунку
- Флаконы T25, T75 и T175: 25, 75 и 175 см²
Сверьтесь с паспортом производителя: площади у разных брендов немного различаются.
Три шага
- Клеток на единицу посуды = плотность × площадь. При 20 000 клеток/см² в 6-луночном планшете: 20 000 × 9,5 = 190 000 клеток на лунку.
- Всего клеток = клеток на единицу × число единиц плюс около 10% на потери при пипетировании. Шесть лунок: 190 000 × 6 × 1,1 = 1 254 000 клеток.
- Объём суспензии = всего клеток ÷ ваш подсчёт в клетках/мл. При 1 000 000 клеток/мл по камере Горяева: 1,25 мл, доведённые средой до нужного общего объёма (6 × 2 мл = 12 мл плюс 10%).
Выбор плотности
Плотность зависит от клеточной линии и от того, когда вы хотите использовать клетки. Чтобы получить нужную конфлюэнтность к определённому дню, считайте назад от времени удвоения: после восстановления от пассажа, обычно примерно через сутки, клетки удваиваются раз в время удвоения. Линия, удваивающаяся каждые 24 часа и посеянная с покрытием 25%, близка к конфлюэнтности через два-три дня. Паспорта поставщиков и опубликованные протоколы дают стартовую плотность для большинства линий.
Равномерный слой
Перемешивайте суспензию прямо перед каждым переносом: клетки оседают за минуту-две. После посева двигайте планшеты крест-накрест (вперёд-назад, влево-вправо), а не круговыми движениями, которые сгоняют клетки к краю каждой лунки, и дайте им осесть 15–30 минут, прежде чем ставить в инкубатор.
Инструменты
Посчитайте клетки в Калькулятор камеры Горяева, затем введите подсчёт и плотность в Калькулятор посева клеток, чтобы получить объёмы суспензии и среды для планшетов и флаконов. Калькулятор времени удвоения клеток находит время удвоения по двум подсчётам.