Формула
Олигонуклеотиды приходят сухими, количество в нмоль указано на пробирке или в паспорте. Для стока в мкМ:
Добавляемый объём (мкл) = нмоль × 1000 ÷ концентрация (мкМ)
Для обычного стока 100 мкМ это просто нмоль × 10: в пробирку с 25,4 нмоль добавляют 254 мкл. Если в паспорте указаны мкг, то нмоль = мкг × 1000 ÷ молекулярная масса.
Шаг за шагом
- Коротко отцентрифугируйте закрытую пробирку, чтобы сухой осадок был на дне, а не на крышке.
- Добавьте рассчитанный объём TE с низким содержанием ЭДТА (10 мМ Tris, 0,1 мМ ЭДТА, pH 8) или воды без нуклеаз.
- Перемешайте на вортексе, оставьте на несколько минут при комнатной температуре, снова перемешайте и осадите.
Рабочий раствор
В ПЦР праймеры обычно используют в концентрации 10 мкМ. Из стока 100 мкМ это разведение 1:10: 10 мкл стока плюс 90 мкл воды или TE дают 100 мкл 10 мкМ. Рабочая пробирка избавляет сток от многократного пипетирования.
Вода или TE?
TE поддерживает pH, а слегка кислая вода может медленно повреждать ДНК, поэтому стоки в TE хранятся дольше. Небольшое количество ЭДТА в TE с низким ЭДТА в рабочих разведениях не связывает достаточно магния, чтобы помешать ПЦР. Для некоторых применений, например части реакций секвенирования, требуется вода.
Хранение
Храните стоки при −20 °C. Разделите их на несколько аликвот, чтобы одна загрязнённая или многократно размороженная пробирка не стоила вам всего заказа; сухие олигонуклеотиды хранятся годами, а стоки в TE — много месяцев в морозилке.
Калькуляторы
Калькулятор растворения олигонуклеотидов даёт объём для любой концентрации стока и состав рабочего раствора. Анализ праймеров ПЦР даёт молекулярную массу праймера, а Калькулятор разведения справится с любым другим разведением.
Объёмы для типичных количеств в пробирке
| Количество на пробирке | Для 100 мкМ | Для 10 мкМ |
|---|---|---|
| 10 нмоль | 100 мкл | 1000 мкл |
| 25 нмоль | 250 мкл | 2500 мкл |
| 40 нмоль | 400 мкл | 4000 мкл |
| 100 нмоль | 1000 мкл | 10 000 мкл |
Поставщики указывают выход после синтеза, который различается от пробирки к пробирке даже в одном заказе, поэтому читайте каждую пробирку, а не исходите из заказанного масштаба.
Насколько хватает стока
ПЦР в 20 мкл с 0,2 мкМ каждого праймера берёт 0,4 мкл рабочего раствора 10 мкМ. Одной пробирки на 25 нмоль при 100 мкМ, разведённой до 10 мкМ, хватает на тысячи реакций, поэтому каждый день вы пользуетесь рабочей пробиркой, а не стоком.
Частые проблемы
- Нет продукта с нового праймера. Убедитесь, что он растворён: в пробирке, открытой до центрифугирования, осадок может остаться на крышке. Перечитайте число нмоль и проверьте добавленный объём.
- Спектрофотометр показывает сток гораздо ниже ожидаемого. Используйте коэффициент экстинкции из паспорта, а не общий. Поглощение олигонуклеотида сильно зависит от последовательности.
- Многократно размороженные праймеры перестают работать. Циклы замораживания-оттаивания и конденсат делают своё дело. Работайте с аликвоты, а основной сток не трогайте.
- Флуоресцентные или модифицированные олигонуклеотиды тускнеют. Храните их в темноте, избегайте повторного замораживания и следуйте указаниям поставщика по хранению, которые часто отличаются от обычных олигонуклеотидов.