Die Formel
Oligos kommen getrocknet, die Menge in nmol steht auf dem Röhrchen oder dem Datenblatt. Für eine Stammlösung in µM gilt:
Zugabevolumen (µL) = nmol × 1.000 ÷ Konzentration (µM)
Für die übliche 100-µM-Stammlösung ist das einfach nmol × 10: Ein Röhrchen mit 25,4 nmol bekommt 254 µL. Steht auf dem Datenblatt µg, gilt nmol = µg × 1.000 ÷ Molekulargewicht.
Schritt für Schritt
- Zentrifugiere das geschlossene Röhrchen kurz, damit das getrocknete Pellet unten und nicht im Deckel sitzt.
- Gib das berechnete Volumen TE mit wenig EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8) oder nukleasefreies Wasser dazu.
- Vortexe, lass es einige Minuten bei Raumtemperatur stehen, vortexe erneut und zentrifugiere kurz.
Eine Arbeitslösung herstellen
In der PCR werden Primer meist mit 10 µM eingesetzt. Aus einer 100-µM-Stammlösung ist das eine 1:10-Verdünnung: 10 µL Stammlösung plus 90 µL Wasser oder TE ergeben 100 µL mit 10 µM. Ein eigenes Arbeitsröhrchen erspart der Stammlösung das ständige Pipettieren.
Wasser oder TE?
TE hält den pH-Wert stabil, und leicht saures Wasser kann DNA langsam schädigen; Stammlösungen in TE halten daher länger. Das wenige EDTA in TE mit wenig EDTA bindet in Arbeitsverdünnung nicht genug Magnesium, um eine PCR zu stören. Manche Anwendungen, etwa bestimmte Sequenzierreaktionen, verlangen Wasser.
Lagerung
Lagere Stammlösungen bei −20 °C. Teile sie in einige Aliquots auf, damit ein verunreinigtes oder zu oft aufgetautes Röhrchen nicht die ganze Bestellung kostet; getrocknete Oligos halten Jahre, Stammlösungen in TE eingefroren viele Monate.
Rechner
Der Oligo-Resuspensionsrechner nennt das Volumen für jede Stammkonzentration und die Mischung für eine Arbeitslösung. PCR-Primer-Statistik liefert das Molekulargewicht eines Primers, und der Verdünnungsrechner erledigt jede andere Verdünnung.