Warum Proteine bei 280 nm absorbieren
Tryptophan und Tyrosin absorbieren UV-Licht bei 280 nm, Disulfidbrücken tragen ein wenig bei. Weil ihr Anteil von Protein zu Protein schwankt, hat jedes Protein seinen eigenen Extinktionskoeffizienten, und eine A280-Messung ist nur so gut wie der verwendete Koeffizient.
Die Formel
Nach dem Lambert-Beer-Gesetz gilt Konzentration (M) = A280 ÷ (ε × Schichtdicke), wobei ε der molare Extinktionskoeffizient in M−1 cm−1 ist. Mit dem Molekulargewicht multipliziert erhältst du mg/mL. Eine Abkürzung ist Abs 0,1 %, die Absorption einer Lösung mit 1 mg/mL, also ε ÷ Molekulargewicht: mg/mL = A280 ÷ Abs 0,1 %.
Den Extinktionskoeffizienten aus der Sequenz
Die Methode von Pace und Kollegen (1995) zählt die absorbierenden Reste:
ε = 5.500 × Trp + 1.490 × Tyr + 125 × Cystine
Ein Cystin sind zwei über eine Disulfidbrücke verbundene Cysteine; für ein reduziertes Protein fällt dieser Term weg.
Ein Rechenbeispiel
Rinderserumalbumin hat ε = 43.824 M−1 cm−1 und ein Molekulargewicht von 66.430 Da, also Abs 0,1 % = 43.824 ÷ 66.430 = 0,66. Ein Messwert von 0,33 in einer 1-cm-Küvette ergibt 0,33 ÷ 0,66 = 0,5 mg/mL oder 7,5 µM.
Fehlerquellen
- Nullabgleich mit demselben Puffer, in dem das Protein ist; Imidazol, Detergenzien und manche Reduktionsmittel absorbieren bei 280 nm.
- Nukleinsäure-Verunreinigungen erhöhen A280. Ein reines Protein hat ein A260/A280-Verhältnis um 0,6; Werte um 1 oder darüber deuten auf DNA oder RNA hin.
- Aggregate streuen Licht und ergeben zu hohe Werte. Trübe Proben zentrifugieren oder filtrieren.
- Halte die Messwerte zwischen etwa 0,1 und 1,0 und verdünne bei Bedarf.
- Proteine ohne Tryptophan und Tyrosin lassen sich so nicht messen; nimm einen Bradford- oder BCA-Test.
Rechner
Der Rechner Proteinkonzentration berechnen (A280) bestimmt den Extinktionskoeffizienten aus einer eingefügten Sequenz oder nimmt einen bekannten Koeffizienten oder Abs 0,1 % und gibt mg/mL und µM aus. Der Lambert-Beer-Rechner löst die allgemeine Gleichung, und Protein-Molekulargewicht liefert die Masse aus einer Sequenz.