Почему белки поглощают при 280 нм
Триптофан и тирозин поглощают ультрафиолет при 280 нм, немного добавляют дисульфидные связи. Поскольку их количество у белков разное, у каждого белка свой коэффициент экстинкции, и показания A280 точны ровно настолько, насколько точен используемый коэффициент.
Формула
По закону Бугера — Ламберта — Бера концентрация (M) = A280 ÷ (ε × длина пути), где ε — молярный коэффициент экстинкции в M−1 см−1. Умножьте на молекулярную массу, чтобы получить мг/мл. Короткий путь — Abs 0,1%, поглощение раствора 1 мг/мл, равное ε ÷ молекулярная масса: мг/мл = A280 ÷ Abs 0,1%.
Коэффициент экстинкции из последовательности
Метод Пейса и соавторов (1995) считает поглощающие остатки:
ε = 5500 × Trp + 1490 × Tyr + 125 × цистины
Цистин — пара цистеинов, соединённых дисульфидной связью; для восстановленного белка это слагаемое не учитывайте.
Разобранный пример
У бычьего сывороточного альбумина ε = 43 824 M−1 см−1 и молекулярная масса 66 430 Да, так что его Abs 0,1% — 43 824 ÷ 66 430 = 0,66. Показание 0,33 в кювете 1 см — это 0,33 ÷ 0,66 = 0,5 мг/мл, или 7,5 мкМ.
Подводные камни
- Обнуляйте прибор по тому же буферу, в котором белок; имидазол, детергенты и некоторые восстановители поглощают при 280 нм.
- Примесь нуклеиновых кислот повышает A280. У чистого белка отношение A260/A280 около 0,6; значения около 1 и выше указывают на ДНК или РНК.
- Агрегаты рассеивают свет и завышают показание. Центрифугируйте или фильтруйте мутные образцы.
- Держите показания примерно между 0,1 и 1,0, при необходимости разводя.
- Белки без триптофана и тирозина так не измерить; используйте метод Брэдфорд или BCA.
Калькуляторы
Калькулятор концентрации белка (A280) рассчитывает коэффициент экстинкции по вставленной последовательности или принимает известный коэффициент или Abs 0,1% и даёт мг/мл и мкМ. Калькулятор закона Бугера — Ламберта — Бера решает общее уравнение, а Молекулярная масса белка даёт массу по последовательности.