Что означает Tm
Температура плавления (Tm) — температура, при которой половина праймера связана с мишенью, а половина свободна. Стадию отжига в ПЦР ставят чуть ниже неё, чтобы праймеры связывались прочно, но только в нужном месте.
Три способа расчёта
- Правило Уоллеса для праймеров короче примерно 14 нуклеотидов: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Быстро, но не учитывает порядок нуклеотидов и буфер.
- Формула по GC-составу для более длинных праймеров: Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ длина. 20-мер с 10 G или C даёт 64,9 + 41 × (10 − 16,4) ÷ 20 = 51,8 °C.
- Термодинамика ближайших соседей, самый точный способ: складывает энергию стэкинга каждой пары соседних нуклеотидов, затем делает поправку на концентрацию праймера и соль в реакции.
Почему важен буфер
Катионы экранируют отрицательный заряд остова ДНК, так что больше соли — выше Tm. Магний действует намного сильнее натрия, а dNTP связывают часть его. Один и тот же праймер может различаться на 5 °C и больше в калькуляторах, предполагающих разные буферы, поэтому задайте концентрации натрия, магния и dNTP своей смеси.
Выбор температуры отжига
Начните примерно на 5 °C ниже меньшей Tm пары. Если продукта нет, понизьте её; если есть лишние полосы, повысьте. Градиентная ПЦР проверяет диапазон за один запуск. Для некоторых высокоточных полимераз производитель даёт свои правила для своего буфера, которые могут дать другую начальную точку.
Практические правила подбора праймеров
- Длина 18–25 нуклеотидов, GC-состав 40–60%.
- Tm двух праймеров в пределах примерно 5 °C друг от друга.
- G или C на 3'-конце, но не больше 3 G или C среди последних 5 нуклеотидов.
- Никаких повторов из 4 и более одинаковых нуклеотидов и участков, спаривающихся с собой или с другим праймером.
Калькуляторы
Калькулятор Tm праймеров использует термодинамику ближайших соседей с вашими концентрациями соли, магния и праймера и предлагает температуру отжига. Анализ праймеров ПЦР сравнивает все три метода и предупреждает о шпильках, самодимерах и повторах.