Калькулятор Tm праймеров
Как рассчитать Tm праймеров
- Вставьте прямой праймер и, если есть, обратный, записанные от 5' к 3'.
- Задайте концентрации праймера, натрия, магния и dNTP вашей ПЦР-смеси.
- Появится Tm каждого праймера с длиной, GC-составом, разницей между ними и начальной температурой отжига.
Частые вопросы
Какой метод используется?
Термодинамика ближайших соседей с параметрами SantaLucia (1998). Магний учитывается как дополнительный натрий, Na⁺ + 120 × √(Mg²⁺ − dNTP), по von Ahsen et al. (2001).
Какую температуру отжига использовать?
Обычная отправная точка — на 5 °C ниже меньшей из двух Tm; лучшую находят градиентной ПЦР. У некоторых полимераз, например высокоточных ферментов в собственных буферах, есть свои калькуляторы Tm и правила производителя, которые дают другие числа.
Насколько близки должны быть две Tm?
В пределах примерно 5 °C, чтобы оба праймера хорошо связывались при одной температуре отжига.
Почему калькуляторы Tm дают разные результаты?
Они используют разные методы и предполагают разные условия реакции. Правило Уоллеса и формула GC вовсе не учитывают буфер, а калькуляторы ближайших соседей различаются наборами параметров, поправками на соль и предполагаемыми концентрациями праймера и магния. Разница в несколько градусов между калькуляторами — нормально. Вводите здесь концентрации своей реакции, а если производитель полимеразы даёт калькулятор для своего буфера, следуйте ему для этого фермента.
Какая простая формула Tm праймера?
Правило Уоллеса, Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C), для праймеров короче примерно 14 оснований или Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ длина для более длинных. Обе не учитывают порядок оснований и буфер, поэтому могут ошибаться на несколько градусов; результат по методу ближайших соседей выше учитывает и то и другое.
Какая Tm нужна праймерам для кПЦР?
Большинство рекомендаций для кПЦР требуют Tm около 58–62 °C с разницей между праймерами 1–2 °C, длину 18–25 оснований, 40–60% GC и ампликон около 70–150 п.н. Гидролизный зонд (TaqMan) обычно на 5–10 °C выше праймеров. Задайте магний как в вашем мастер-миксе — часто 3 мМ и больше, выше, чем в обычной ПЦР.