분주 밀도는 면적 기준
부착 세포는 보통 배양 면적 1 cm²당 세포 수로 분주합니다. 같은 밀도면 어떤 용기에서든 같은 덮임 정도가 되기 때문입니다. 대표적인 배양 면적은 다음과 같습니다.
- 96웰 플레이트: 웰당 0.32 cm²
- 24웰 플레이트: 웰당 1.9 cm²
- 12웰 플레이트: 웰당 3.8 cm²
- 6웰 플레이트: 웰당 9.5 cm²
- T25, T75, T175 플라스크: 25, 75, 175 cm²
제조사마다 면적이 조금 다르니 제품 사양서를 확인하세요.
세 단계
- 용기당 세포 수 = 밀도 × 면적. 6웰 플레이트에 20,000세포/cm²라면 20,000 × 9.5 = 웰당 190,000세포.
- 총 세포 수 = 용기당 세포 수 × 용기 수에 피펫팅 손실분 약 10%를 더합니다. 6웰이면 190,000 × 6 × 1.1 = 1,254,000세포.
- 현탁액 부피 = 총 세포 수 ÷ 계수한 세포 농도(세포/mL). 혈구계산기로 1,000,000세포/mL라면 1.25 mL를 넣고, 필요한 전체 부피(6 × 2 mL = 12 mL에 10% 추가)까지 배지로 채웁니다.
밀도 정하기
밀도는 세포주와 세포를 쓸 시점에 따라 정합니다. 정해진 날에 목표 컨플루언스에 이르게 하려면 배가 시간으로 거꾸로 계산하세요. 계대 후 회복하고 나면(보통 약 하루 뒤) 세포는 배가 시간마다 한 번씩 두 배가 됩니다. 24시간마다 배가하는 세포주를 25% 덮임으로 분주하면 2~3일 뒤 거의 컨플루언트가 됩니다. 공급사 자료나 발표된 프로토콜에 대부분 세포주의 초기 밀도가 나와 있습니다.
고르게 분주하는 요령
세포는 1~2분이면 가라앉으므로 옮기기 직전마다 현탁액을 섞으세요. 분주한 뒤에는 원을 그리듯 흔들면 세포가 웰 가장자리로 몰리므로 앞뒤·좌우 십자로 움직이고, 15~30분 두어 세포가 가라앉은 뒤 인큐베이터에 넣습니다.
도구
혈구계산기 계산으로 세포를 센 다음, 그 값과 밀도를 세포 분주 계산기에 넣으면 플레이트와 플라스크에 필요한 현탁액과 배지 부피가 나옵니다. 세포 배가 시간 계산기는 두 번의 계수로 배가 시간을 구합니다.