Die Formel
Kopien = (Masse in ng × 6,022 × 1023) ÷ (Länge in bp × 660 × 109)
660 g/mol ist die mittlere Masse eines Basenpaars doppelsträngiger DNA (etwa 330 pro Base bei einzelsträngiger DNA und 340 bei RNA), 6,022 × 1023 ist die Avogadro-Zahl und 109 rechnet Nanogramm in Gramm um. Je länger das Molekül, desto weniger Kopien stecken in einem Nanogramm.
Ein Rechenbeispiel
Wie viele Moleküle sind in 1 ng eines 5.000-bp-Plasmids?
- Molare Masse: 5.000 × 660 = 3,3 × 106 g/mol.
- Mol: 1 × 10−9 g ÷ 3,3 × 106 g/mol = 3,03 × 10−16 mol.
- Kopien: 3,03 × 10−16 × 6,022 × 1023 = 1,8 × 108 Kopien.
Eine Faustregel: 1 ng eines 1-kb-Fragments sind etwa 9 × 108 Kopien, und 1 ng von 1 bp wären 9 × 1011, also durch die Länge in bp teilen.
Von Kopien zurück zur Masse
Umgestellt: Masse (ng) = Kopien × Länge × 660 × 109 ÷ 6,022 × 1023. Für 106 Kopien desselben Plasmids sind das 106 × 5.000 × 660 × 109 ÷ 6,022 × 1023 = 5,5 × 10−3 ng, also 5,5 pg.
Eine qPCR-Standardkurve
Absolute Quantifizierung braucht Standards mit bekannter Kopienzahl. Miss die Plasmidkonzentration, rechne sie in Kopien pro µL um und stelle dann Zehnfach-Verdünnungsreihen her, etwa von 108 bis 102 Kopien pro µL. Lass sie neben den Proben laufen; Ct gegen log Kopien aufgetragen sollte eine Gerade mit einer Steigung nahe −3,3 ergeben (100 % Effizienz). Linearisiertes Plasmid liefert genauere Standards als superhelikales, und ein Carrier wie tRNA oder Hefe-RNA verhindert, dass Verdünnungen mit wenigen Kopien an der Röhrchenwand haften.
Rechner
Der DNA-Kopienzahl-Rechner rechnet für DNA oder RNA beliebiger Länge zwischen Nanogramm und Kopien um. Die Konzentration aus einem A260-Wert liefert der DNA-Konzentrationsrechner; für relative statt absoluter Quantifizierung nutzt du den ΔΔCt-Rechner.