Wie das Gel funktioniert
SDS umhüllt Proteine mit negativer Ladung proportional zu ihrer Länge, sodass sie im elektrischen Feld nur nach Größe durch das Polyacrylamid-Netz wandern. Das Gel hat zwei Schichten: ein kurzes Sammelgel mit niedrigem pH und niedrigem Prozentsatz, das jede Probe zu einer dünnen Bande bündelt, und darunter ein Trenngel, das die Proteine auftrennt.
Den Prozentsatz wählen
- 8 %: etwa 40 bis 200 kDa
- 10 %: etwa 20 bis 150 kDa
- 12 %: etwa 15 bis 100 kDa, eine übliche Allzweckwahl
- 15 %: etwa 10 bis 70 kDa
Das Sammelgel hat meist 4 % oder 5 %.
Was jede Zutat macht
- Acrylamid/Bis: bildet das Gelnetz; der Prozentsatz bestimmt die Porengröße.
- Tris-HCl: pH 8,8 mit 0,375 M im Trenngel, pH 6,8 mit 0,125 M im Sammelgel. Dieser pH-Unterschied sorgt für das Sammeln der Proben.
- SDS: 0,1 %, hält die Proteine denaturiert und geladen.
- APS und TEMED: starten die Polymerisation. Gib sie zuletzt dazu, denn das Gel beginnt innerhalb von Minuten fest zu werden.
Die Gele gießen
- Setz die Glasplatten zusammen und prüfe sie mit Wasser auf Dichtigkeit.
- Misch das Trenngel, gib APS und TEMED dazu, schwenk und gieß bis etwa 1,5 cm unter die Stelle, an der die Kammzähne enden.
- Überschichte mit Isopropanol oder Wasser für eine glatte Kante und lass es 20 bis 30 Minuten fest werden.
- Gieß die Überschichtung ab, misch das Sammelgel mit APS und TEMED, gieß es darauf und setz den Kamm ein.
- Lass es fest werden, zieh den Kamm und spül die Taschen.
Unpolymerisiertes Acrylamid ist ein Nervengift: Trage Handschuhe und geh vorsichtig mit den Lösungen um.
Rechner
Der SDS-PAGE-Gel-Rechner listet jedes Volumen für Trenn- und Sammelgel bei jedem Prozentsatz und jeder Gelzahl. Um gleiche Proteinmengen aufzutragen, miss deine Proben mit dem Rechner Proteinkonzentration berechnen (A280).