Zellviabilität berechnen

Die Formel

Viabilität (%) = lebende Zellen ÷ (lebende Zellen + tote Zellen) × 100

Lebende und tote Zellen in denselben Quadraten zählen, damit sich Verdünnung und Kammervolumen herauskürzen; die Viabilität ist ein Verhältnis und muss nicht in Zellen pro mL umgerechnet werden.

Wie Trypanblau funktioniert

Trypanblau kann eine intakte Zellmembran nicht durchdringen. Lebende Zellen schließen es aus und bleiben unter dem Mikroskop hell; tote Zellen mit beschädigter Membran nehmen es auf und werden blau. Zellen und 0,4 % Trypanblau 1:1 mischen, höchstens ein paar Minuten warten und zählen: Der Farbstoff ist giftig, und nach etwa 5 Minuten färben sich auch lebende Zellen, was die Viabilität schlechter aussehen lässt, als sie ist.

Ein Rechenbeispiel

Vier große Quadrate ergeben 58, 62, 55 und 61 lebende Zellen (Mittel 59) und 6, 8, 5 und 9 tote (Mittel 7).

• Viabilität = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = 89 %.
• Lebende Zellen pro mL = 59 × 2 (Trypanblau-Verdünnung) × 10⁴ = 1,18 × 10⁶.

Für die Aussaatmenge die Zahl der lebenden Zellen verwenden, nicht die Gesamtzahl.

Was akzeptabel ist

Gesunde Kulturen in der logarithmischen Phase liegen über 90 % Viabilität, und die meisten Experimente verlangen mindestens 85 bis 90 %. Frisch aufgetaute Zellen können bei 60 bis 80 % liegen und erholen sich nach einer Passage. Mit Trypsin abgelöste Zellen verlieren ein paar Prozent; zu lange in Trypsin belassene, grob pipettierte oder eine Stunde auf Eis gehaltene Zellen verlieren mehr. Ein Viabilitätsabfall zwischen Passagen ist ein frühes Zeichen für Kontamination, verbrauchtes Medium oder ein Problem mit dem Inkubator.

Häufige Fehler

• Trümmer und gefärbte Fragmente als tote Zellen zu zählen senkt den Wert; blasse, geschwollene Zellen als lebend zu zählen erhöht ihn.
• Tote Zellen lysieren und verschwinden in der Kultur, daher zeigt eine Viabilitätszählung nur das kürzliche Sterben, nicht alles, was gestorben ist.
• Trypanblau übersieht Zellen in früher Apoptose, die den Farbstoff noch ausschließen; wenn das wichtig ist, Annexin V oder einen Farbstoff wie Propidiumiodid in der Durchflusszytometrie verwenden.

Rechner

Der Zählkammer-Rechner nimmt lebende und tote Zählungen und liefert Viabilität und lebende Zellen pro mL. Der Zellaussaat-Rechner berechnet, wie viel pipettiert wird, und der Rechner für die Verdopplungszeit verfolgt das Wachstum zwischen Passagen.