Rumusnya
viabilitas (%) = sel hidup ÷ (sel hidup + sel mati) × 100
Hitung sel hidup dan mati di kotak yang sama, sehingga pengenceran dan volume kamar saling meniadakan; viabilitas adalah rasio dan tidak perlu dikonversi ke sel per mL.
Cara kerja tripan biru
Tripan biru tidak dapat menembus membran sel yang utuh. Sel hidup menolaknya dan tetap terang di bawah mikroskop; sel mati dengan membran rusak menyerapnya dan menjadi biru. Campur sel dan tripan biru 0,4% dengan perbandingan 1:1, tunggu paling lama beberapa menit, lalu hitung: pewarnanya toksik dan setelah sekitar 5 menit sel hidup pun mulai terwarnai, yang membuat viabilitas tampak lebih buruk dari sebenarnya.
Contoh perhitungan
Empat kotak besar memberikan hitungan sel hidup 58, 62, 55, dan 61 (rata-rata 59) dan sel mati 6, 8, 5, dan 9 (rata-rata 7).
- Viabilitas = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = 89%.
- Sel hidup per mL = 59 × 2 (pengenceran tripan biru) × 104 = 1,18 × 106.
Gunakan hitungan sel hidup, bukan total, saat menghitung berapa banyak yang ditanam.
Berapa yang dapat diterima
Kultur sehat di fase log viabilitasnya di atas 90%, dan kebanyakan percobaan menginginkan setidaknya 85 sampai 90%. Sel yang baru dicairkan bisa 60 sampai 80% dan pulih setelah satu pasase. Sel yang dilepas dengan tripsin kehilangan beberapa persen; sel yang terlalu lama dalam tripsin, dipipet kasar, atau disimpan di es selama satu jam kehilangan lebih banyak. Penurunan viabilitas antar pasase adalah tanda awal kontaminasi, medium yang habis, atau masalah pada inkubator.
Kesalahan umum
- Menghitung debris dan pecahan terwarnai sebagai sel mati menurunkan angka; menghitung sel yang redup dan membengkak sebagai hidup menaikkannya.
- Sel mati mengalami lisis dan menghilang di kultur, jadi hitungan viabilitas hanya menunjukkan kematian baru-baru ini, bukan semua yang mati.
- Tripan biru melewatkan sel pada apoptosis awal, yang masih menolak pewarna; gunakan annexin V atau pewarna seperti propidium iodida dengan flow cytometry jika itu penting.
Kalkulator
Kalkulator Hemositometer menerima hitungan hidup dan mati lalu memberikan viabilitas dan sel hidup per mL. Kalkulator Penanaman Sel menghitung berapa banyak yang dipipet, dan Kalkulator Waktu Penggandaan Sel melacak pertumbuhan antar pasase.