A fórmula
viabilidade (%) = células vivas ÷ (células vivas + células mortas) × 100
Conte vivas e mortas nos mesmos quadrados, para que a diluição e o volume da câmara se cancelem; viabilidade é uma razão e não precisa ser convertida em células por mL.
Como o azul de tripan funciona
O azul de tripan não atravessa uma membrana celular intacta. Células vivas o excluem e ficam brilhantes ao microscópio; células mortas, com membrana danificada, o absorvem e ficam azuis. Misture células e azul de tripan 0,4% em proporção 1:1, espere no máximo alguns minutos e conte: o corante é tóxico e, depois de uns 5 minutos, células vivas também começam a corar, o que faz a viabilidade parecer pior do que é.
Um exemplo resolvido
Quatro quadrados grandes dão contagens de vivas de 58, 62, 55 e 61 (média 59) e de mortas de 6, 8, 5 e 9 (média 7).
- Viabilidade = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = 89%.
- Células vivas por mL = 59 × 2 (diluição do azul de tripan) × 104 = 1,18 × 106.
Use a contagem de vivas, não o total, ao calcular quanto semear.
O que é aceitável
Culturas saudáveis em fase log ficam acima de 90% de viabilidade, e a maioria dos experimentos pede pelo menos 85 a 90%. Células recém-descongeladas podem estar em 60 a 80% e se recuperam depois de uma passagem. Células soltas com tripsina perdem alguns pontos; células deixadas tempo demais na tripsina, pipetadas com força ou mantidas no gelo por uma hora perdem mais. Uma queda de viabilidade entre passagens é um sinal precoce de contaminação, meio esgotado ou problema na incubadora.
Erros comuns
- Contar debris e fragmentos corados como células mortas reduz o número; contar células fracas e inchadas como vivas o aumenta.
- Células mortas se lisam e somem na cultura, então uma contagem de viabilidade só mostra a morte recente, não tudo o que morreu.
- O azul de tripan não detecta células em apoptose inicial, que ainda excluem o corante; use anexina V ou um corante como iodeto de propídio com citometria de fluxo quando isso importar.
Calculadoras
A Calculadora de hemocitômetro recebe contagens de vivas e mortas e dá a viabilidade e as células vivas por mL. A Calculadora de semeadura de células calcula quanto pipetar, e a Calculadora de tempo de duplicação celular acompanha o crescimento entre passagens.