Cara Membuat Master Mix PCR

Mengapa memakai master mix

Memipet setiap komponen ke setiap tabung itu lambat dan menambah sedikit galat setiap kali. Master mix menggabungkan semua yang sama untuk setiap reaksi dalam satu tabung, lalu dibagi ke tabung-tabung sebelum templat dimasukkan. Setiap reaksi mendapat campuran yang sama, dan Anda jauh lebih sedikit memipet volume kecil.

Konsentrasi akhir yang umum

• Buffer: 1× (dari stok 10× atau 5×).
• dNTP: masing-masing 0,2 mM.
• MgCl₂: 1,5 sampai 2,5 mM, jika buffer belum mengandungnya.
• Primer: masing-masing 0,1 sampai 0,5 µM.
• Taq polimerase: sekitar 1,25 unit per reaksi 50 µL.
• Templat: 1 pg sampai 100 ng, tergantung sumbernya.

Ikuti manual polimerase Anda jika berbeda; enzim high-fidelity khususnya punya rekomendasi sendiri.

Menghitung volume

Untuk tiap komponen, volume per reaksi = konsentrasi akhir ÷ konsentrasi stok × volume reaksi. Dalam reaksi 25 µL, buffer 10× perlu 2,5 µL dan primer 10 µM menjadi 0,5 µM perlu masing-masing 1,25 µL. Air menggenapkan sisa volume setelah templat.

Kalikan tiap volume dengan jumlah reaksi ditambah sekitar 10%, karena sebagian cairan hilang di tip dan dinding tabung. Untuk 10 reaksi, buat untuk 11.

Menyusunnya

1. Cairkan komponen di atas es, lalu vorteks dan sentrifus singkat (kecuali polimerase).
2. Masukkan air dulu, lalu buffer, dNTP, MgCl₂, dan primer.
3. Tambahkan polimerase terakhir, campur perlahan dengan memipet atau menjentik, lalu sentrifus.
4. Bagi mix ke tabung-tabung, lalu tambahkan templat masing-masing. Sertakan kontrol tanpa templat dengan air.

Kalkulator

Kalkulator master mix PCR menghitung setiap volume untuk berapa pun jumlah reaksi. Periksa suhu annealing primer dengan Kalkulator Tm Primer, dan buat stok primer dengan kalkulator resuspensi oligo.