PCR मास्टर मिक्स कैसे बनाएँ

मास्टर मिक्स क्यों

हर घटक को हर ट्यूब में पिपेट करना धीमा है और हर बार थोड़ी गलती जोड़ता है। मास्टर मिक्स सभी अभिक्रियाओं में साझा चीज़ें एक ट्यूब में जोड़ता है, जिसे टेम्पलेट डालने से पहले ट्यूबों में बाँटा जाता है। हर अभिक्रिया को वही मिक्स मिलता है, और छोटे आयतन बहुत कम पिपेट करने पड़ते हैं।

आम अंतिम सांद्रताएँ

• बफ़र: 1× (10× या 5× स्टॉक से)।
• dNTP: हर एक 0.2 mM।
• MgCl₂: 1.5 से 2.5 mM, अगर बफ़र में पहले से न हो।
• प्राइमर: हर एक 0.1 से 0.5 µM।
• Taq पॉलीमरेज़: 50 µL अभिक्रिया में लगभग 1.25 यूनिट।
• टेम्पलेट: स्रोत के हिसाब से 1 pg से 100 ng।

जहाँ आपकी पॉलीमरेज़ की मैनुअल अलग हो, उसे मानें; ख़ासकर हाई-फ़िडेलिटी एंज़ाइम की अपनी सिफ़ारिशें होती हैं।

आयतन निकालना

हर घटक के लिए प्रति अभिक्रिया आयतन = अंतिम सांद्रता ÷ स्टॉक सांद्रता × अभिक्रिया आयतन। 25 µL अभिक्रिया में 10× बफ़र के लिए 2.5 µL और 10 µM प्राइमर को 0.5 µM करने के लिए हर एक 1.25 µL लगता है। टेम्पलेट के बाद बाक़ी आयतन पानी से भरें।

हर आयतन को अभिक्रियाओं की संख्या और लगभग 10% अतिरिक्त से गुणा करें, क्योंकि कुछ द्रव टिप और ट्यूब की दीवारों पर रह जाता है। 10 अभिक्रियाओं के लिए 11 का बनाएँ।

मिलाना

1. घटकों को बर्फ़ पर पिघलाएँ, फिर वॉर्टेक्स करें और थोड़ा घुमा लें (पॉलीमरेज़ को छोड़कर)।
2. पहले पानी डालें, फिर बफ़र, dNTP, MgCl₂ और प्राइमर।
3. पॉलीमरेज़ सबसे आख़िर में डालें, पिपेटिंग या हल्की थपकी से धीरे मिलाएँ और घुमा लें।
4. मिक्स को ट्यूबों में बाँटें, फिर हर एक में टेम्पलेट डालें। टेम्पलेट की जगह पानी वाला नियंत्रण भी रखें।

कैलकुलेटर

PCR मास्टर मिक्स कैलकुलेटर किसी भी संख्या की अभिक्रियाओं के लिए हर आयतन निकालता है। प्राइमर का एनीलिंग तापमान प्राइमर Tm कैलकुलेटर से जाँचें, और प्राइमर स्टॉक ओलिगो रीसस्पेंशन कैलकुलेटर से बनाएँ।