Cara menghitung efisiensi transformasi

Rumusnya

Efisiensi transformasi adalah jumlah koloni yang akan Anda peroleh per mikrogram DNA plasmid jika semuanya disebar:

efisiensi (cfu/µg) = koloni × (volume total ÷ volume yang disebar) × faktor pengenceran ÷ µg DNA

Efisiensi diukur dengan sejumlah plasmid kontrol yang diketahui, tidak dipotong dan supercoiled seperti pUC19, karena hasilnya bergantung pada plasmid sama besarnya dengan pada sel.

Contoh perhitungan

Anda menambahkan 10 pg (0,00001 µg) pUC19 ke 50 µL sel kompeten, menambahkan 950 µL SOC setelah kejut panas (total 1.000 µL), dan menyebar 100 µL dari pengenceran 1:10. Keesokan harinya ada 45 koloni.

1. Fraksi yang disebar: 100 ÷ 1.000 = 0,1, jadi kalikan 10.
2. Pengenceran: 1:10, jadi kalikan 10 lagi.
3. Koloni per transformasi: 45 × 10 × 10 = 4.500.
4. Per µg: 4.500 ÷ 0,00001 = 4,5 × 10⁸ cfu/µg.

Berapa angka yang baik?

• Sel kompeten kimiawi buatan sendiri: 10⁶ sampai 10⁷ cfu/µg.
• Sel kompeten kimiawi komersial: 10⁸ sampai 10⁹.
• Sel elektrokompeten: 10⁹ sampai 10¹⁰.

Ligasi menghasilkan koloni per µg jauh lebih sedikit daripada plasmid kontrol, sering seratus sampai seribu kali lebih sedikit, karena DNA hasil ligasi kebanyakan linear atau relaks dan bufer ligasi menghambat transformasi.

Mengapa efisiensi turun

DNA terlalu banyak (lebih dari sekitar 100 ng per 50 µL sel) menjenuhkan sel dan menurunkan angka per µg. Garam, etanol, atau bufer ligase dalam DNA, sel yang menghangat sebelum kejut panas, sel yang dicairkan lalu dibekukan lagi, dan melewatkan tahap pemulihan semuanya memangkas efisiensi. Plasmid besar bertransformasi lebih buruk daripada yang kecil.

Kalkulator

Kalkulator Efisiensi Transformasi menghitungnya dari koloni, DNA, volume, dan pengenceran. Periksa jumlah DNA dengan Kalkulator Konsentrasi DNA, dan ubah nanogram menjadi molekul dengan Kalkulator Jumlah Salinan DNA.