Cara menghitung jumlah salinan DNA

Rumusnya

salinan = (massa dalam ng × 6,022 × 10²³) ÷ (panjang dalam bp × 660 × 10⁹)

660 g/mol adalah massa rata-rata satu pasangan basa DNA untai ganda (sekitar 330 per basa untuk DNA untai tunggal dan 340 untuk RNA), 6,022 × 10²³ adalah bilangan Avogadro, dan 10⁹ mengubah nanogram menjadi gram. Makin panjang molekulnya, makin sedikit salinan dalam satu nanogram.

Contoh perhitungan

Berapa molekul dalam 1 ng plasmid 5.000 bp?

1. Massa molar: 5.000 × 660 = 3,3 × 10⁶ g/mol.
2. Mol: 1 × 10⁻⁹ g ÷ 3,3 × 10⁶ g/mol = 3,03 × 10⁻¹⁶ mol.
3. Salinan: 3,03 × 10⁻¹⁶ × 6,022 × 10²³ = 1,8 × 10⁸ salinan.

Aturan praktis: 1 ng fragmen 1 kb kira-kira 9 × 10⁸ salinan, dan 1 ng dari 1 bp akan menjadi 9 × 10¹¹, jadi bagi dengan panjang dalam bp.

Dari salinan kembali ke massa

Disusun ulang: massa (ng) = salinan × panjang × 660 × 10⁹ ÷ 6,022 × 10²³. Untuk 10⁶ salinan plasmid yang sama, itu 10⁶ × 5.000 × 660 × 10⁹ ÷ 6,022 × 10²³ = 5,5 × 10⁻³ ng, atau 5,5 pg.

Kurva standar qPCR

Kuantifikasi absolut memerlukan standar dengan jumlah salinan yang diketahui. Ukur konsentrasi plasmid, ubah ke salinan per µL, lalu buat pengenceran bertingkat sepuluh kali dari, misalnya, 10⁸ sampai 10² salinan per µL. Jalankan bersama sampel; plot Ct terhadap log salinan harus berupa garis lurus dengan kemiringan mendekati −3,3 (efisiensi 100%). Plasmid yang dilinearkan memberi standar lebih akurat daripada yang supercoiled, dan pembawa seperti tRNA atau RNA ragi mencegah pengenceran bersalinan rendah menempel ke dinding tabung.

Kalkulator

Kalkulator Jumlah Salinan DNA mengonversi antara nanogram dan salinan untuk DNA atau RNA dengan panjang berapa pun. Dapatkan konsentrasi dari pembacaan A260 dengan Kalkulator Konsentrasi DNA; untuk kuantifikasi relatif alih-alih absolut, gunakan Kalkulator ΔΔCt.