Qué necesitas
Los Ct de un gen diana y de un gen de referencia (un gen constitutivo como GAPDH o ACTB cuya expresión no cambia con el tratamiento), medidos en una muestra tratada y en una muestra control.
Los tres pasos
- Normaliza cada muestra con el gen de referencia: ΔCt = Ct diana − Ct referencia.
- Compara tratada con control: ΔΔCt = ΔCt tratada − ΔCt control.
- Conviértelo en cambio de expresión: cambio = 2−ΔΔCt.
Un ejemplo resuelto
Tratada: Ct diana 22,1, Ct referencia 18,0, así que ΔCt = 4,1. Control: Ct diana 24,5, Ct referencia 18,0, así que ΔCt = 6,5.
ΔΔCt = 4,1 − 6,5 = −2,4, y el cambio = 22,4 = 5,3. La diana se expresa unas 5,3 veces más en la muestra tratada. Un cambio menor que 1 indica menos expresión; 0,5 es la mitad.
Cuándo no basta con 2^-ΔΔCt
El método supone que las dos parejas de cebadores tienen una eficiencia cercana al 100%, es decir, que el producto se duplica en cada ciclo. Compruébalo con una curva estándar; lo habitual es entre el 90% y el 110%. Si las eficiencias difieren, usa el método de Pfaffl, que incluye la eficiencia de cada gen: razón = EdianaΔCt diana ÷ EreferenciaΔCt referencia, donde cada ΔCt es control menos tratada y E = 1 + eficiencia.
Réplicas y estadística
- Promedia las réplicas técnicas (pocillos de la misma muestra) antes de calcular el ΔCt.
- Haz la estadística con los valores de ΔCt o ΔΔCt de las réplicas biológicas, no con los cambios de expresión, porque estos no siguen una distribución normal.
- Indica el log2 del cambio, que es simplemente −ΔΔCt, cuando quieras ver aumentos y disminuciones en la misma escala.
Calculadora
La calculadora ΔΔCt promedia las réplicas, da ΔCt, ΔΔCt, el cambio de expresión y su log2, y pasa al método de Pfaffl cuando introduces las eficiencias de los cebadores. Para cuantificación absoluta con curva estándar, la calculadora de número de copias de ADN calcula las copias de cada estándar.