लायोफ़िलाइज़्ड प्रोटीन या पेप्टाइड को कैसे घोलें

फ़ॉर्मूला

डालने का आयतन = वायल में द्रव्यमान ÷ लक्ष्य सांद्रता

इकाइयाँ मिलाकर रखें: mg ÷ mg/mL से mL मिलता है, और µg ÷ µg/µL से µL।

उदाहरण

• 5 mg पेप्टाइड को 2 mg/mL पर: 5 ÷ 2 = 2.5 mL।
• 100 µg एंटीबॉडी को 0.5 mg/mL (0.5 µg/µL) पर: 100 ÷ 0.5 = 200 µL।
• 1,500 g/mol वाले पेप्टाइड का 1 mg, 1 mM पर: 0.001 g ÷ 1,500 g/mol = 0.667 µmol, और 0.667 µmol ÷ 1 mmol/L = 667 µL।

देखें कि वायल में असल में कितना है

सिंथेटिक पेप्टाइड का पाउडर पूरा पेप्टाइड नहीं होता। ट्राइफ़्लोरोएसीटेट जैसे काउंटर-आयन और बँधा हुआ पानी अक्सर वज़न का 10% से 30% होते हैं, इसलिए विश्लेषण प्रमाणपत्र में नेट पेप्टाइड मात्रा, मसलन 80%, लिखी हो सकती है। गणना से पहले कुल द्रव्यमान को इस अंश से गुणा करें: 80% पर 5 mg में 4 mg पेप्टाइड है। प्रोटीन के लिए डेटाशीट में मात्रा देखें, और घोलने के बाद 280 nm पर अवशोषण से सांद्रता की पुष्टि करें।

विलायक चुनना

• पहले डेटाशीट मानें। ज़्यादातर प्रोटीन और एंटीबॉडी पानी में या उसी बफ़र में वापस घोले जाते हैं जिससे उन्हें फ़्रीज़-ड्राई किया गया था।
• ज़्यादा क्षारीय अवशेषों (K, R, H) वाले पेप्टाइड थोड़े तनु एसिटिक अम्ल में बेहतर घुलते हैं; अम्लीय (D, E) वाले थोड़े तनु अमोनियम बाइकार्बोनेट में।
• बहुत हाइड्रोफ़ोबिक पेप्टाइड को पहले थोड़े DMSO और फिर बफ़र में धीरे-धीरे तनुकरण की ज़रूरत पड़ सकती है। सिस्टीन या मेथियोनीन वाले पेप्टाइड के लिए DMSO से बचें, क्योंकि वह उन्हें ऑक्सीकृत कर सकता है।

चरण

1. खोलने से पहले वायल को कमरे के तापमान पर आने दें, ताकि पाउडर पर नमी न जमे।
2. थोड़ी देर सेंट्रीफ़्यूज करें ताकि सारा पाउडर तली में आ जाए।
3. विलायक को वायल की दीवार के सहारे धीरे-धीरे डालें।
4. हल्के से घुमाएँ या लुढ़काएँ और 15 से 30 मिनट छोड़ दें। प्रोटीन को ज़ोर से वॉर्टेक्स न करें, इससे वे विकृत हो सकते हैं और झाग बन सकता है।
5. अगर घोल धुंधला रहे, तो पेप्टाइड के लिए थोड़ी देर का अल्ट्रासोनिक बाथ मदद कर सकता है। जो कण फिर भी बचें वे घुले नहीं हैं: उन्हें सेंट्रीफ़्यूज करके नीचे बिठाएँ और ऊपर के द्रव की सांद्रता मापें।

रखना

घोल को एक बार इस्तेमाल लायक एलिकोट में बाँटें और −20 °C या −80 °C पर जमा दें, क्योंकि हर बार जमाने और पिघलाने से सक्रियता घट सकती है। लगभग 0.1 mg/mL से तनु प्रोटीन ट्यूब की दीवार से चिपकते हैं; अगर प्रयोग पर असर न पड़े तो 0.1% BSA जैसा वाहक प्रोटीन इसे रोकता है।

कैलकुलेटर

रीकॉन्स्टिट्यूशन कैलकुलेटर लक्ष्य सांद्रता के लिए आयतन, या आयतन से सांद्रता, द्रव्यमान या मोलर इकाइयों में देता है। नतीजे को प्रोटीन सांद्रता कैलकुलेटर (A280) से जाँचें, और काम के तनुकरण स्टॉक सॉल्यूशन कैलकुलेटर से तय करें।