Rumusnya
volume yang ditambahkan = massa dalam vial ÷ konsentrasi target
Samakan satuannya: mg ÷ mg/mL menghasilkan mL, dan µg ÷ µg/µL menghasilkan µL.
Contoh
- 5 mg peptida pada 2 mg/mL: 5 ÷ 2 = 2,5 mL.
- 100 µg antibodi pada 0,5 mg/mL (0,5 µg/µL): 100 ÷ 0,5 = 200 µL.
- 1 mg peptida 1.500 g/mol pada 1 mM: 0,001 g ÷ 1.500 g/mol = 0,667 µmol, dan 0,667 µmol ÷ 1 mmol/L = 667 µL.
Periksa berapa isi vial sebenarnya
Serbuk peptida sintetis tidak seluruhnya peptida. Ion lawan seperti trifluoroasetat dan air terikat sering mencapai 10% sampai 30% dari berat, sehingga sertifikat analisis bisa mencantumkan kandungan peptida bersih, misalnya 80%. Kalikan massa kotor dengan pecahan itu sebelum menghitung: 5 mg pada 80% adalah 4 mg peptida. Untuk protein, periksa jumlahnya di lembar data, dan setelah dilarutkan, pastikan konsentrasinya dengan absorbansi pada 280 nm.
Memilih pelarut
- Ikuti lembar data lebih dulu. Sebagian besar protein dan antibodi dikembalikan ke air atau buffer tempat mereka dibekukeringkan.
- Peptida dengan banyak residu basa (K, R, H) lebih mudah larut dalam sedikit asam asetat encer; peptida asam (D, E) dalam sedikit amonium bikarbonat encer.
- Peptida yang sangat hidrofobik mungkin perlu sedikit DMSO dulu, lalu diencerkan perlahan ke buffer. Hindari DMSO untuk peptida yang mengandung sistein atau metionin, yang bisa dioksidasinya.
Langkah-langkah
- Biarkan vial mencapai suhu ruang sebelum dibuka, agar uap air tidak mengembun di serbuk.
- Sentrifugasi sebentar agar semua serbuk berada di dasar.
- Tambahkan pelarut perlahan melalui dinding vial.
- Putar atau gulingkan perlahan dan diamkan 15 sampai 30 menit. Jangan memvorteks protein dengan keras, karena bisa terdenaturasi dan berbusa.
- Jika masih keruh, sonikasi singkat dalam bak ultrasonik bisa membantu peptida. Partikel yang tersisa tidak larut: endapkan dengan sentrifugasi dan ukur konsentrasi supernatannya.
Menyimpan
Bagi larutan menjadi alikuot sekali pakai dan bekukan pada −20 °C atau −80 °C, karena tiap siklus beku–cair bisa mengurangi aktivitas. Protein encer di bawah sekitar 0,1 mg/mL menempel di dinding tabung; protein pembawa seperti BSA 0,1% mencegahnya bila tidak mengganggu percobaan.
Kalkulator
Kalkulator Rekonstitusi memberi volume untuk konsentrasi target, atau konsentrasi dari suatu volume, dalam satuan massa atau molar. Periksa hasilnya dengan Kalkulator Konsentrasi Protein (A280), dan rencanakan pengenceran kerja dengan Kalkulator Larutan Stok.