A fórmula
volume a adicionar = massa no frasco ÷ concentração desejada
Mantenha as unidades combinando: mg ÷ mg/mL dá mL, e µg ÷ µg/µL dá µL.
Exemplos
- 5 mg de peptídeo a 2 mg/mL: 5 ÷ 2 = 2,5 mL.
- 100 µg de anticorpo a 0,5 mg/mL (0,5 µg/µL): 100 ÷ 0,5 = 200 µL.
- 1 mg de um peptídeo de 1.500 g/mol a 1 mM: 0,001 g ÷ 1.500 g/mol = 0,667 µmol, e 0,667 µmol ÷ 1 mmol/L = 667 µL.
Confira quanto há de fato no frasco
O pó de um peptídeo sintético não é só peptídeo. Contraíons como o trifluoroacetato e a água ligada costumam ser de 10% a 30% do peso, então o certificado de análise pode indicar um teor líquido de peptídeo de, por exemplo, 80%. Multiplique a massa bruta por essa fração antes de calcular: 5 mg a 80% são 4 mg de peptídeo. Para proteínas, confira a quantidade na ficha técnica e, depois de dissolver, confirme a concentração pela absorbância a 280 nm.
Escolher o solvente
- Siga primeiro a ficha técnica. A maioria das proteínas e anticorpos volta para água ou para o tampão em que foram liofilizados.
- Peptídeos com muitos resíduos básicos (K, R, H) se dissolvem melhor em um pouco de ácido acético diluído; os ácidos (D, E), em um pouco de bicarbonato de amônio diluído.
- Peptídeos muito hidrofóbicos podem precisar primeiro de um volume pequeno de DMSO e depois de uma diluição lenta em tampão. Evite DMSO com peptídeos que tenham cisteína ou metionina, que ele pode oxidar.
Etapas
- Deixe o frasco chegar à temperatura ambiente antes de abrir, para que a umidade não condense sobre o pó.
- Centrifugue rapidamente para que todo o pó fique no fundo.
- Adicione o solvente devagar pela parede do frasco.
- Gire ou role com cuidado e deixe de 15 a 30 minutos. Não passe proteínas no vórtex com força, o que pode desnaturá-las e fazer espuma.
- Se continuar turvo, um banho de ultrassom curto pode ajudar com peptídeos. As partículas que sobrarem não estão dissolvidas: centrifugue-as e meça a concentração do sobrenadante.
Guardar
Divida a solução em alíquotas de uso único e congele a −20 °C ou −80 °C, porque cada ciclo de congelamento e descongelamento pode custar atividade. Proteínas diluídas abaixo de cerca de 0,1 mg/mL grudam nas paredes do tubo; uma proteína carreadora como BSA a 0,1% evita isso quando não interfere no experimento.
Calculadoras
A Calculadora de reconstituição dá o volume para uma concentração desejada, ou a concentração a partir de um volume, em unidades de massa ou molares. Confira o resultado com a Calculadora de concentração de proteínas (A280) e planeje as diluições de trabalho com a Calculadora de solução estoque.