Como desenhar primers de qPCR

Como os primers de qPCR diferem dos de PCR

Uma qPCR mede a rapidez com que o produto se acumula, ciclo a ciclo, então os primers precisam copiar o alvo com eficiência próxima de 100% e gerar um único produto. Isso pede amplicons curtos e regras mais rígidas do que numa PCR de clonagem, em que qualquer quantidade da banda certa basta. As regras gerais estão em Como desenhar primers de PCR; aqui estão as que mudam na qPCR.

As regras

• Amplicon: cerca de 70 a 150 pb. Um produto curto é copiado por inteiro em cada ciclo, o que mantém a eficiência alta.
• Comprimento do primer: 18 a 25 bases.
• Tm: cerca de 58 a 62 °C, com os dois primers a no máximo 1 a 2 °C um do outro, calculada com o sal e o magnésio do seu master mix.
• Teor de GC: 40% a 60%, com no máximo 3 G ou C nas últimas 5 bases da ponta 3′.
• Evite: sequências de 4 ou mais bases iguais, principalmente G, e trechos que pareiam com o próprio primer ou com o outro. Dímeros de primers pesam mais com SYBR Green, que faz brilhar qualquer DNA de fita dupla, inclusive dímeros.

Sondas

Uma sonda de hidrólise (TaqMan) se liga entre os dois primers e é desenhada com Tm cerca de 5 a 10 °C acima da deles, para já estar ligada quando os primers começam a estender. Evite um G na ponta 5′, ao lado do fluoróforo, porque um G ali apaga a fluorescência.

Para medir mRNA: atravesse uma junção éxon-éxon

Para expressão gênica a partir de cDNA, ponha um primer sobre uma junção éxon-éxon, ou os dois primers em éxons diferentes com um íntron longo entre eles. Assim o DNA genômico que restar no RNA não gera produto, ou gera um longo demais para amplificar bem. Um controle sem RT, RNA que passa pela reação sem transcriptase reversa, mostra se ainda passa DNA genômico.

Verifique os primers antes de encomendar

1. Calcule as duas Tm com a calculadora de Tm de primers, usando o magnésio do seu master mix, que muitas vezes é de 3 mM ou mais.
2. Procure grampos, autodímeros e uma ponta 3′ fraca ou pegajosa demais com o PCR Primer Stats.
3. Cole o molde no PCR Products para confirmar um único produto do tamanho esperado, e busque os primers no genoma inteiro, por exemplo com o NCBI Primer-BLAST, para descartar outros alvos.

Verifique no laboratório

Faça uma série de diluições do molde, cinco ou mais passos de 10 vezes, e plote o Ct contra o log da quantidade com a calculadora de curva padrão. A inclinação dá a eficiência: E = 10^{−1/inclinação} − 1. Uma inclinação de −3,32 significa 100%, e de 90% a 110% é em geral aceito. Com SYBR Green, uma curva de melting com um só pico nítido indica um único produto, e o controle sem molde deve ficar plano. Depois calcule a expressão relativa com a calculadora de ΔΔCt, que usa o método de Pfaffl quando as eficiências dos dois pares de primers diferem.