qPCR-Primer designen

Was qPCR-Primer von PCR-Primern unterscheidet

Eine qPCR misst, wie schnell ein Produkt Zyklus für Zyklus entsteht, also müssen die Primer ihr Ziel mit nahezu 100 % Effizienz kopieren und nur ein Produkt bilden. Das verlangt kurze Amplikons und strengere Regeln als eine Klonierungs-PCR, bei der jede Menge der richtigen Bande genügt. Die allgemeinen Regeln stehen in PCR-Primer designen; hier stehen die, die sich bei der qPCR ändern.

Die Regeln

• Amplikon: etwa 70 bis 150 bp. Ein kurzes Produkt wird in jedem Zyklus vollständig kopiert, das hält die Effizienz hoch.
• Primerlänge: 18 bis 25 Basen.
• Tm: etwa 58 bis 62 °C, die beiden Primer höchstens 1 bis 2 °C auseinander, berechnet für Salz und Magnesium deines Master-Mixes.
• GC-Gehalt: 40 % bis 60 %, mit höchstens 3 G oder C in den letzten 5 Basen am 3′-Ende.
• Vermeide: Folgen von 4 oder mehr gleichen Basen, vor allem G, und Abschnitte, die mit dem Primer selbst oder dem anderen Primer paaren. Primerdimere fallen vor allem bei SYBR Green ins Gewicht, das jede doppelsträngige DNA leuchten lässt, Dimere eingeschlossen.

Sonden

Eine Hydrolysesonde (TaqMan) bindet zwischen den beiden Primern und wird mit einer Tm etwa 5 bis 10 °C über deren Tm entworfen, damit sie schon gebunden ist, wenn die Primer verlängert werden. Vermeide ein G am 5′-Ende neben dem Reporterfarbstoff, denn ein G dort löscht die Fluoreszenz.

mRNA messen: über eine Exon-Exon-Grenze

Für die Genexpression aus cDNA legst du einen Primer über eine Exon-Exon-Grenze, oder die beiden Primer in verschiedene Exons mit einem langen Intron dazwischen. Genomische DNA, die in der RNA verblieben ist, ergibt dann kein Produkt oder eines, das zu lang ist, um gut amplifiziert zu werden. Eine No-RT-Kontrolle, RNA ohne reverse Transkriptase, zeigt, ob trotzdem genomische DNA durchkommt.

Primer vor der Bestellung prüfen

1. Berechne beide Tm mit dem Primer-Tm-Rechner, mit dem Magnesium deines Master-Mixes, das oft bei 3 mM oder mehr liegt.
2. Suche mit PCR Primer Stats nach Haarnadeln, Selbstdimeren und einem schwachen oder zu klebrigen 3′-Ende.
3. Füge die Matrize in PCR Products ein, um ein einziges Produkt der erwarteten Größe zu bestätigen, und suche die Primer im ganzen Genom, etwa mit NCBI Primer-BLAST, um andere Ziele auszuschließen.

Im Labor prüfen

Setze eine Verdünnungsreihe der Matrize an, fünf oder mehr 10-fach-Schritte, und trage Ct gegen den Logarithmus der Menge auf, etwa mit dem Standardkurven-Rechner. Die Steigung ergibt die Effizienz: E = 10^{−1/Steigung} − 1. Eine Steigung von −3,32 bedeutet 100 %, und 90 % bis 110 % gelten allgemein als akzeptabel. Bei SYBR Green zeigt eine Schmelzkurve mit einem scharfen Peak ein einziges Produkt, und die Kontrolle ohne Matrize sollte flach bleiben. Danach berechnest du die relative Expression mit dem ΔΔCt-Rechner, der die Pfaffl-Methode nutzt, wenn sich die Effizienzen der beiden Primerpaare unterscheiden.