qPCR 프라이머가 일반 PCR 프라이머와 다른 점
qPCR은 사이클마다 산물이 얼마나 빨리 쌓이는지를 재기 때문에, 프라이머가 표적을 100%에 가까운 효율로 복제하고 산물을 하나만 만들어야 합니다. 그래서 맞는 밴드가 조금만 나와도 되는 클로닝용 PCR보다 증폭 산물을 짧게 하고 규칙도 더 엄격합니다. 일반적인 규칙은 PCR 프라이머 설계 방법에 있고, 여기서는 qPCR에서 달라지는 점을 정리합니다.
규칙
- 증폭 산물: 약 70~150 bp. 짧은 산물은 매 사이클 끝까지 복제되어 효율이 높게 유지됩니다.
- 프라이머 길이: 18~25염기.
- Tm: 약 58~62 °C, 두 프라이머의 차이는 1~2 °C 이내. 사용하는 마스터 믹스의 염과 마그네슘 농도로 계산합니다.
- GC 함량: 40~60%, 3′ 말단의 마지막 5염기에 G나 C가 3개를 넘지 않게 합니다.
- 피할 것: 같은 염기가 4개 이상 이어지는 부분(특히 G)과 프라이머 자신이나 다른 프라이머와 결합하는 부분. 프라이머 이량체는 이량체를 포함한 모든 이중가닥 DNA를 빛나게 하는 SYBR Green에서 특히 문제가 됩니다.
프로브
가수분해(TaqMan) 프로브는 두 프라이머 사이에 결합하며, 프라이머가 신장을 시작할 때 이미 붙어 있도록 Tm을 프라이머보다 5~10 °C 높게 설계합니다. 리포터 형광 물질 옆인 5′ 말단에 G가 있으면 형광이 소광되므로 피하세요.
mRNA를 잴 때: 엑손 경계에 걸치기
cDNA로 유전자 발현을 잴 때는 프라이머 하나를 엑손-엑손 경계에 걸치게 놓거나, 두 프라이머를 긴 인트론을 사이에 둔 서로 다른 엑손에 놓습니다. 그러면 RNA에 남은 유전체 DNA는 산물을 만들지 못하거나, 너무 길어서 잘 증폭되지 않습니다. 역전사효소 없이 반응시킨 RNA(no-RT 대조군)로 유전체 DNA가 섞여 들어오는지 확인할 수 있습니다.
주문 전에 프라이머 확인하기
- 프라이머 Tm 계산기로 두 Tm을 계산합니다. 마그네슘은 마스터 믹스 농도에 맞추며, 3 mM 이상인 경우가 많습니다.
- PCR Primer Stats로 헤어핀, 자가 이량체, 너무 약하거나 너무 잘 붙는 3′ 말단이 없는지 봅니다.
- 주형을 PCR Products에 붙여 넣어 예상 크기의 산물이 하나만 나오는지 확인하고, NCBI Primer-BLAST 등으로 유전체 전체를 검색해 다른 표적이 없는지 확인합니다.
실험으로 확인하기
주형의 희석 계열(10배씩 5단계 이상)을 만들고 표준 곡선 계산기로 Ct를 양의 로그에 대해 그립니다. 기울기로 효율을 구합니다: E = 10−1/기울기 − 1. 기울기 −3.32가 100%이고, 90~110%가 일반적으로 허용됩니다. SYBR Green에서는 용융 곡선의 피크가 하나로 날카로우면 산물이 하나이고, 주형 없는 대조군은 평평해야 합니다. 그다음 ΔΔCt 계산기로 상대 발현량을 구합니다. 두 프라이머 쌍의 효율이 다르면 Pfaffl 방법을 씁니다.