Proteinler neden 280 nm’de soğurur
Triptofan ve tirozin morötesi ışığı 280 nm’de soğurur, disülfit bağları da biraz ekler. Her birinin miktarı proteinden proteine değiştiği için her proteinin kendi sönüm katsayısı vardır ve A280 okumaları ancak kullandığın katsayı kadar iyidir.
Formül
Beer-Lambert yasasından, derişim (M) = A280 ÷ (ε × yol uzunluğu); burada ε, M−1 cm−1 cinsinden molar sönüm katsayısıdır. mg/mL için molekül ağırlığıyla çarp. Bir kestirme, 1 mg/mL’lik bir çözeltinin absorbansı olan Abs 0,1%’dir; bu ε ÷ molekül ağırlığıdır: mg/mL = A280 ÷ Abs 0,1%.
Sönüm katsayısını diziden bulmak
Pace ve arkadaşlarının yöntemi (1995) soğuran kalıntıları sayar:
ε = 5.500 × Trp + 1.490 × Tyr + 125 × sistin
Sistin, bir disülfit bağıyla birleşmiş bir sistein çiftidir; indirgenmiş bir protein için bu terimi çıkar.
Çözümlü bir örnek
Sığır serum albüminin ε’u 43.824 M−1 cm−1, molekül ağırlığı 66.430 Da’dur; yani Abs 0,1%’i 43.824 ÷ 66.430 = 0,66’dır. 1 cm’lik bir küvette 0,33’lük bir okuma 0,33 ÷ 0,66 = 0,5 mg/mL ya da 7,5 µM’dır.
Tuzaklar
- Proteinin içinde bulunduğu aynı tamponla kör al; imidazol, deterjanlar ve bazı indirgeyiciler 280 nm’de soğurur.
- Nükleik asit kirliliği A280’i yükseltir. Saf bir proteinin A260/A280 oranı 0,6 civarındadır; 1’e yakın ya da üstündeki değerler DNA ya da RNA olduğunu düşündürür.
- Kümeler ışığı saçar ve yüksek okur. Bulanık örnekleri santrifüjle ya da süz.
- Okumaları gerekirse seyrelterek yaklaşık 0,1 ile 1,0 arasında tut.
- Triptofan ya da tirozin içermeyen proteinler bu yolla ölçülemez; Bradford ya da BCA analizi kullan.
Hesaplayıcılar
Protein derişimi hesaplayıcı (A280) sönüm katsayısını yapıştırılan bir diziden hesaplar ya da bilinen bir katsayıyı veya Abs 0,1%’i alır ve mg/mL ile µM verir. Beer-Lambert yasası hesaplayıcı genel denklemi çözer, Protein molekül ağırlığı da bir diziden kütleyi verir.