Jel nasıl çalışır
SDS, proteinleri uzunluklarıyla orantılı olarak negatif yükle kaplar; böylece bir elektrik alanında poliakrilamid ağının içinden yalnızca boyutlarına göre ilerlerler. Jelin iki katmanı vardır: her örneği ince bir banda sıkıştıran, düşük pH’lı ve düşük yüzdeli kısa bir yığma jeli ve altında proteinleri ayıran bir ayırma jeli.
Yüzdeyi seç
- %8: yaklaşık 40 ila 200 kDa
- %10: yaklaşık 20 ila 150 kDa
- %12: yaklaşık 15 ila 100 kDa, yaygın bir genel seçim
- %15: yaklaşık 10 ila 70 kDa
Yığma jeli genellikle %4 ya da %5’tir.
Her bileşen ne yapar
- Akrilamid/bis: jel ağını oluşturur; yüzdesi gözenek boyutunu belirler.
- Tris-HCl: ayırma jelinde 0,375 M’da pH 8,8; yığma jelinde 0,125 M’da pH 6,8. Örneklerin yığılmasını sağlayan bu pH farkıdır.
- SDS: %0,1; proteinleri denatüre ve yüklü tutar.
- APS ve TEMED: polimerleşmeyi başlatır. Jel dakikalar içinde donmaya başladığı için onları en son ekle.
Jelleri dök
- Cam plakaları birleştir ve suyla sızıntı kontrolü yap.
- Ayırma jelini karıştır, APS ve TEMED’i ekle, çalkala ve tarağın dişlerinin ulaşacağı yerin yaklaşık 1,5 cm altına kadar dök.
- Düz bir kenar için üzerine izopropanol ya da su koy ve 20 ila 30 dakika donmaya bırak.
- Üstteki sıvıyı dök, yığma jelini APS ve TEMED’iyle karıştır, üstüne dök ve tarağı yerleştir.
- Donmaya bırak, sonra tarağı çıkar ve kuyucukları çalkala.
Polimerleşmemiş akrilamid bir nörotoksindir: eldiven giy ve çözeltileri dikkatle kullan.
Hesaplayıcılar
SDS-PAGE jel hesaplayıcı her yüzde ve jel sayısı için ayırma ve yığma jellerinin tüm hacimlerini listeler. Eşit miktarda protein yüklemek için örneklerini Protein derişimi hesaplayıcı (A280) ile ölç.