Formül
Oligolar kurutulmuş olarak gelir; miktar nmol olarak tüpte ya da veri sayfasında yazar. µM cinsinden bir stok için:
Eklenecek hacim (µL) = nmol × 1.000 ÷ derişim (µM)
Olağan 100 µM stok için bu basitçe nmol × 10’dur: 25,4 nmol’lük bir tüp 254 µL alır. Sayfa bunun yerine µg veriyorsa nmol = µg × 1.000 ÷ molekül ağırlığı.
Adım adım
- Kurutulmuş çökelti kapakta değil dipte olsun diye kapalı tüpü kısa süre santrifüjle.
- Hesaplanan hacimde düşük EDTA’lı TE (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8) ya da nükleazsız su ekle.
- Vortexle, oda sıcaklığında birkaç dakika beklet, yeniden vortexle ve santrifüjle.
Çalışma çözeltisi yapmak
PCR genellikle primerleri 10 µM’da kullanır. 100 µM’lık bir stoktan bu 1:10’luk bir seyreltmedir: 10 µL stok artı 90 µL su ya da TE, 10 µM’da 100 µL yapar. Bir çalışma tüpü kullanmak stoku tekrarlanan pipetlemeden uzak tutar.
Su mu TE mi?
TE pH’ı sabit tutar ve hafif asidik su DNA’ya yavaş yavaş zarar verebilir; bu yüzden TE’deki stoklar daha uzun dayanır. Düşük EDTA’lı TE’deki az miktarda EDTA, çalışma seyreltmelerinde bir PCR’ı bozacak kadar magnezyum bağlamaz. Bazı dizileme tepkimeleri gibi bazı uygulamalar bunun yerine su ister.
Saklama
Stokları −20 °C’de tut. Kirlenen ya da çok kez çözdürülen tek bir tüp tüm siparişe mal olmasın diye onları birkaç alikota böl; kurutulmuş oligolar yıllarca, TE’deki stoklar dondurulmuş olarak aylarca dayanır.
Hesaplayıcılar
Oligo çözündürme hesaplayıcı her stok derişimi için hacmi ve bir çalışma çözeltisinin karışımını verir. PCR primer istatistikleri bir primerin molekül ağırlığını verir, Seyreltme hesaplayıcı da diğer her seyreltmeyi halleder.
Yaygın tüp miktarları için hacimler
| Tüpteki miktar | 100 µM için | 10 µM için |
|---|---|---|
| 10 nmol | 100 µL | 1.000 µL |
| 25 nmol | 250 µL | 2.500 µL |
| 40 nmol | 400 µL | 4.000 µL |
| 100 nmol | 1.000 µL | 10.000 µL |
Tedarikçiler sentezden sonraki verimi belirtir ve bu, aynı siparişte bile tüpten tüpe değişir; bu yüzden sipariş edilen ölçeği varsaymak yerine her tüpü oku.
Bir stok ne kadar gider
Her primerden 0,2 µM ile 20 µL’lik bir PCR, 10 µM’lık bir çalışma çözeltisinden 0,4 µL alır. 100 µM’da 25 nmol’lük bir tüp, 10 µM’ya seyreltildiğinde binlerce tepkimeye yeter; gün gün kullandığın şeyin stok değil çalışma tüpü olmasının nedeni budur.
Yaygın sorunlar
- Yeni bir primerden ürün yok. Çözündürüldüğünü doğrula: santrifüjlenmeden önce açılan bir tüp çökeltiyi kapağa kaptırabilir. nmol değerini yeniden oku ve eklediğin hacmi kontrol et.
- Stok spektrofotometrede beklenenden çok düşük okuyor. Genel bir değer değil, veri sayfasındaki sönüm katsayısını kullan. Oligo absorbansı diziye güçlü biçimde bağlıdır.
- Çok kez çözdürülmüş primerler çalışmaz oluyor. Dondurma-çözdürme döngüleri ve yoğuşma ikisi de yıpratır. Bir alikottan çalış ve ana stoğa dokunma.
- Floresan ya da değiştirilmiş oligolar soluyor. Onları karanlıkta tut, tekrar tekrar dondurmaktan kaçın ve çoğu zaman düz oligolardan farklı olan tedarikçi saklama notuna uy.