Tm ne demek
Erime sıcaklığı (Tm), primerin yarısının hedefine bağlı, yarısının serbest olduğu sıcaklıktır. PCR’ın bağlanma adımı onun biraz altına ayarlanır; böylece primerler sıkıca ama yalnızca doğru yere bağlanır.
Hesaplamanın üç yolu
- Yaklaşık 14 bazın altındaki primerler için Wallace kuralı: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Hızlıdır, ama bazların sırasını ve tamponu yok sayar.
- Daha uzun primerler için GC formülü: Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ uzunluk. 10 G ya da C’li bir 20-mer 64,9 + 41 × (10 − 16,4) ÷ 20 = 51,8 °C verir.
- En doğrusu, en yakın komşu termodinamiği: her komşu baz çiftinin istiflenme enerjisini toplar, sonra primer derişimine ve tepkimedeki tuza göre düzeltir.
Tampon neden önemli
Katyonlar DNA omurgasının negatif yükünü perdeler; bu yüzden daha çok tuz daha yüksek Tm demektir. Magnezyumun etkisi sodyumunkinden çok daha güçlüdür ve dNTP’ler onun bir kısmını bağlar. Aynı primer, farklı tamponları varsayan hesaplayıcılar arasında 5 °C ya da daha fazla fark edebilir; bu yüzden kendi karışımının sodyum, magnezyum ve dNTP derişimlerini ayarla.
Bağlanma sıcaklığını seçmek
Çiftin düşük olan Tm’sinin yaklaşık 5 °C altından başla. Ürün görmezsen düşür; fazladan bantlar görürsen yükselt. Bir gradyan PCR bir aralığı tek çalıştırmada test eder. Bazı yüksek doğruluklu polimerazlar, farklı bir başlangıç noktası verebilen, üreticilerinin kendi tamponları için kurallarıyla gelir.
Primer tasarımı için pratik kurallar
- 18–25 baz uzunluğunda, %40–60 GC.
- İki primerin Tm’si birbirinin yaklaşık 5 °C yakınında.
- 3' ucunda bir G ya da C, ama son 5 bazda en fazla 3 G ya da C.
- Tek bir bazın 4 ya da daha fazla tekrarı yok, kendisiyle ya da öbür primerle eşleşen bölüm yok.
Hesaplayıcılar
Primer Tm hesaplayıcı senin tuz, magnezyum ve primer derişimlerinle en yakın komşu termodinamiğini kullanır ve bir bağlanma sıcaklığı önerir. PCR primer istatistikleri üç yöntemi karşılaştırır ve firketeler, kendi kendine dimerler ve tekrarlar hakkında uyarır.