A260’tan DNA derişimi nasıl hesaplanır

Absorbanstan derişime

Nükleik asitler morötesi ışığı 260 nm’de soğurur. 1 cm’lik yolla 1,0’lık bir A260 yaklaşık şuna karşılık gelir:

• Çift zincirli DNA için 50 ng/µL
• RNA için 40 ng/µL
• Tek zincirli DNA için 33 ng/µL

Derişim = A260 × katsayı × seyreltme. 1:10 seyreltilmiş ve 0,25 okuyan bir örnek 0,25 × 50 × 10 = 125 ng/µL dsDNA içerir. Okumalar yaklaşık 0,1 ile 1,0 arasında en güvenilirdir; daha güçlü örnekleri seyrelt. Kısa oligolar baz bileşimine göre daha çok değişir, bu yüzden kendi sönüm katsayılarından hesaplanmaları daha iyidir.

Saflık oranları

• A260/280 DNA için 1,8, RNA için 2,0 civarı. Daha düşük değerler protein ya da fenol olduğunu düşündürür.
• A260/230 2,0–2,2 civarı. Daha düşük değerler hazırlıktan kalan guanidin tuzlarını, EDTA’yı ya da karbonhidratları düşündürür.

ng’den kopyaya

qPCR standartları için molekül sayısına ihtiyacın vardır. dsDNA’nın bir baz çifti yaklaşık 618 g/mol’dür; yani 3.000 bp’lik bir plazmitin 1 ng’si yaklaşık 3,2 × 10⁸ kopyadır.

Hesaplayıcılar

DNA derişimi hesaplayıcı okumalarını ve seyreltmeyi alır ve oranları kontrol eder. DNA kopya sayısı hesaplayıcı ng ile kopya arasında dönüştürür. Diğer moleküller için Beer-Lambert yasası hesaplayıcı sönüm katsayısından çalışır.

Kopya sayısı adım adım

Kopya = gram cinsinden kütle × 6,022 × 10²³ ÷ (bp cinsinden uzunluk × 618). 3.000 bp’lik bir plazmitin 1 ng’ı için: 1 × 10⁻⁹ × 6,022 × 10²³ ÷ (3.000 × 618) = 6,022 × 10¹⁴ ÷ 1.854.000 = 3,25 × 10⁸ kopya. Bazı protokoller baz çifti başına 650 g/mol kullanır ve bu yaklaşık %5 daha az verir.

Belirli bir miktarı pipetlemek

125 ng/µL’lik bir stoktan bir tepkimeye 100 ng koymak için 100 ÷ 125 = 0,8 µL gerekir; bu da doğru pipetlenemeyecek kadar küçüktür. Önce stoğu 1:10 seyreltip 12,5 ng/µL yap ve bunun yerine 8 µL ekle.

Yaygın sorunlar

• DNA okuması çok yüksek. RNA da 260 nm’de soğurur; yani içinde RNA olan bir DNA preparatı yüksek okur. RNaz ile işle ya da yalnızca DNA’yı gören boya tabanlı bir tayin kullan.
• Temiz DNA için 260/280 oranı düşük. Tamponlanmamış su hafif asidiktir ve oranı 0,2 ila 0,3 düşürebilir. TE gibi bir tamponda seyrelt ve körü onunla al.
• Okumalar damlalar arasında zıplıyor. Ölçmeden önce örneği karıştır, iki tabanı da sil ve mikrohacim aletlerinde baloncuklara dikkat et.
• Negatif ya da çok küçük bir okuma. Kör, örnekten farklı bir tampon kullanmıştır ya da örnek aletin kullanışlı aralığının altındadır.