Neden ana karışım kullanılır
Her bileşeni her tüpe pipetlemek yavaştır ve her seferinde küçük bir hata ekler. Ana karışım, tepkimelerin ortak her şeyini tek bir tüpte birleştirir; bu karışım, kalıp eklenmeden önce tüplere bölünür. Her tepkime aynı karışımı alır ve çok daha az küçük hacim pipetlersin.
Tipik son derişimler
- Tampon: 1× (10× ya da 5× stoktan).
- dNTP’ler: her biri 0,2 mM.
- MgCl2: tampon zaten içermiyorsa 1,5 ila 2,5 mM.
- Primerler: her biri 0,1 ila 0,5 µM.
- Taq polimeraz: 50 µL’lik tepkime başına yaklaşık 1,25 ünite.
- Kalıp: kaynağına bağlı olarak 1 pg ila 100 ng.
Farklı olduğu yerde polimerazının kılavuzuna uy; özellikle yüksek doğruluklu enzimlerin kendi önerileri vardır.
Hacimleri hesaplamak
Her bileşen için tepkime başına hacim = son derişim ÷ stok derişimi × tepkime hacmi. 25 µL’lik bir tepkimede 10× tampon 2,5 µL; 0,5 µM’da 10 µM’lık primerler de her biri 1,25 µL ister. Su, kalıptan sonra hacmin geri kalanını tamamlar.
Uçlarda ve tüp duvarlarında bir miktar sıvı kaybolduğu için her hacmi tepkime sayısı artı yaklaşık %10 fazlayla çarp. 10 tepkime için 11’e yetecek kadar hazırla.
Karışımı hazırlamak
- Bileşenleri buz üzerinde çözdür, sonra kısa süre vortexle ve santrifüjle (polimeraz hariç).
- Önce suyu, sonra tamponu, dNTP’leri, MgCl2’yi ve primerleri ekle.
- Polimerazı en son ekle, pipetleyerek ya da fiskeyle hafifçe karıştır ve santrifüjle.
- Karışımı tüplere böl, sonra her kalıbı ekle. Kalıp yerine su içeren bir kalıpsız kontrol ekle.
Hesaplayıcılar
PCR ana karışım hesaplayıcı her sayıda tepkime için her hacmi hesaplar. Primerlerinin bağlanma sıcaklığını Primer Tm hesaplayıcı ile kontrol et ve primer stoklarını Oligo çözündürme hesaplayıcı ile hazırla.