Primer Tm hesaplayıcı

Primer Tm nasıl hesaplanır

1. İleri primeri ve varsa geri primeri 5'ten 3'e yazılmış olarak yapıştır.
2. PCR karışımının primer, sodyum, magnezyum ve dNTP derişimlerini ayarla.
3. Her primerin Tm değeri uzunluğu, GC içeriği, ikisi arasındaki fark ve bir başlangıç bağlanma sıcaklığıyla birlikte görünür.

Sık sorulan sorular

Hangi yöntemi kullanıyor?

SantaLucia (1998) parametreleriyle en yakın komşu termodinamiği. Magnezyum, von Ahsen ve ark. (2001) izlenerek ek sodyum olarak sayılır: Na⁺ + 120 × √(Mg²⁺ − dNTP’ler).

Hangi bağlanma sıcaklığını kullanmalıyım?

Yaygın bir başlangıç noktası iki Tm değerinin düşük olanından 5 °C aşağısıdır; gradyan PCR en iyisini bulur. Kendi tamponlarındaki yüksek doğruluklu enzimler gibi bazı polimerazların üreticisinin kendi Tm hesaplayıcısı ve kuralları vardır ve bunlar farklı sayılar verir.

İki Tm değeri birbirine ne kadar yakın olmalı?

Yaklaşık 5 °C içinde; böylece iki primer de aynı bağlanma sıcaklığında iyi bağlanır.

Tm hesaplayıcıları neden farklı sonuçlar veriyor?

Farklı yöntemler kullanırlar ve farklı tepkimeler varsayarlar. Wallace kuralı ve GC formülü tamponu tamamen yok sayar; en yakın komşu hesaplayıcıları ise parametre takımlarında, tuz düzeltmelerinde ve varsaydıkları primer ve magnezyum derişimlerinde farklılaşır. Hesaplayıcılar arasında birkaç derece fark normaldir. Burada kendi tepkimenin derişimlerini gir; bir polimeraz üreticisi kendi tamponu için bir hesaplayıcı veriyorsa o enzim için onu izle.

Primer Tm için basit formül nedir?

Yaklaşık 14 bazın altındaki primerler için Wallace kuralı, Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C); daha uzunlar için Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ uzunluk. İkisi de bazların sırasını ve tamponu yok sayar; bu yüzden birkaç derece sapabilirler. Yukarıdaki en yakın komşu sonucu ikisini de hesaba katar.

qPCR primerlerinin Tm değeri ne olmalı?

Çoğu qPCR kılavuzu yaklaşık 58–62 °C’lik bir Tm, iki primer arasında 1–2 °C fark, 18–25 baz, %40–60 GC ve yaklaşık 70–150 bp’lik bir amplikon ister. Hidroliz (TaqMan) probu genellikle primerlerden 5–10 °C yukarıdadır. Magnezyumu ana karışımınınkine ayarla; bu çoğu zaman standart PCR’dekinden yüksek, 3 mM ya da daha fazladır.