Standart eğri ne işe yarar
Bradford, BCA, ELISA ve qPCR gibi birçok tayin derişimle artan ama sabit, bilinen bir miktarla artmayan bir okuma verir. Derişimi bilinen örnekleri, yani standartları aynı anda ölçmek, o çalışmada okumanın derişimle nasıl ilişkili olduğunu gösterir; bilinmeyen örnekler bu ilişkiden okunur.
Standartları hazırlamak
- Beklediğin aralığı kapsayan, bir kör (sıfır) dahil 5 ila 8 standart kullan.
- Tampon ikisini de eşit etkilesin diye onları örneklerinle aynı tamponda hazırla.
- Onları tek bir stoktan seyreltmeyle hazırla ve örneklerle birlikte ikili ya da üçlü çalış.
Doğruyu uydurmak
Okumayı derişime karşı çiz ve en küçük kareler yöntemiyle bir doğru uydur: okuma = eğim × derişim + kesişim. Sonra her bilinmeyen için:
derişim = (okuma − kesişim) ÷ eğim
Örnek ölçümden önce seyreltildiyse seyreltme faktörüyle çarp.
Çözümlü bir örnek
0, 250, 500 ve 1.000 µg/mL’lik BSA standartları 0,05, 0,37, 0,66 ve 1,21 absorbans verir. Uydurulan doğru yaklaşık okuma = 0,00115 × derişim + 0,068’dir. 1:5 seyreltilmiş bir örnek 0,48 okur: kuyucukta (0,48 − 0,068) ÷ 0,00115 = 358 µg/mL, yani özgün örnekte yaklaşık 1,8 mg/mL.
Eğriyi değerlendirmek
- Yaklaşık 0,99’un üstündeki R² olağandır. Daha düşük bir değer bir pipetleme hatasına ya da aykırı bir değere işaret eder.
- Standartların içinde kal. En yüksek standardın üstündeki okumalar ekstrapolasyondur; örneği seyreltip yeniden ölç.
- Eğriliğe dikkat et. Birçok tayin yüksek derişimlerde düzleşir. Doğrudan sapan üst standartları çıkar ya da daha dar bir aralık kullan.
Hesaplayıcılar
Standart eğri hesaplayıcı doğruyu uydurur, R²’yi verir ve her bilinmeyeni seyreltmesiyle birlikte hesaplar. Standartları Seri seyreltme hesaplayıcı ile planla; saflaştırılmış proteinler için Protein derişimi hesaplayıcı (A280) bir eğri yerine A280 kullanır.