كيف تحسب كمية الإدخال للربط

لماذا نسبة مولية

يعتمد الربط على عدد أطراف DNA، لا على كتلتها. الإدخال الصغير فيه جزيئات لكل ng أكثر بكثير من الناقل الكبير، فالكتل المتساوية تعطي أعداد جزيئات مختلفة جدًا. لذلك تعطي البروتوكولات نسبة مولية بين الإدخال والناقل، 3:1 في الغالب.

الصيغة

الإدخال (ng) = الناقل (ng) × طول الإدخال ÷ طول الناقل × النسبة

مع 50 ng من ناقل طوله 3000 bp وإدخال طوله 1000 bp بنسبة 3:1: ‏50 × 1000 ÷ 3000 × 3 = 50 ng من الإدخال.

نصائح

• جرّب 1:1 و3:1 و5:1 إن أعطت المحاولة الأولى مستعمرات قليلة.
• الإدخالات القصيرة جدًا، مثل قليلات النيوكليوتيد المهجَّنة، تحتاج عادةً نسبًا أعلى.
• أضف تفاعل ربط بالناقل وحده كضابط لخلفية الناقل غير المقطوع أو المعاد ربطه.
• قِس التراكيز بعد التنقية، لا قبلها.

الحاسبة

تعطي حاسبة الربط كمية الإدخال بالـ ng لأي نسبة، ومع تركيز الإدخال، الحجم الذي يجب سحبه بالماصة. قِس ذلك التركيز بـ حاسبة تركيز DNA.

مثال بالأحجام

في المثال أعلاه تحتاج 50 ng من الناقل و50 ng من الإدخال. إن كان الناقل بتركيز 50 ng/µL والإدخال بتركيز 25 ng/µL:

• الناقل: 50 ÷ 50 = 1 µL.
• الإدخال: 50 ÷ 25 = 2 µL.
• محلول الليغاز المنظم 10×: ‏2 µL. ‏T4 DNA ligase: ‏1 µL.
• ماء حتى 20 µL: ‏14 µL.

التحقق بالمولات

زوج قواعد من DNA مزدوج السلسلة يزن نحو 650 g/mol، فـ pmol = ng × 1,000 ÷ (bp × 650). الناقل 50,000 ÷ (3,000 × 650) ≈ 0.026 pmol والإدخال 50,000 ÷ (1,000 × 650) ≈ 0.077 pmol، أي ثلاثة أضعاف.

مستعمرات قليلة أو لا شيء

• يتحلل الـ ATP في محلول الليغاز مع كل تجميد وإذابة. احفظ المحلول في حصص صغيرة.
• الأطراف الصريحة تُربط أسوأ بكثير من اللزجة؛ استخدم ليغاز أكثر وحضانة أطول.
• الناقل المنزوع الفوسفات يحتاج إدخالًا يحتفظ بفوسفات 5′؛ ونواتج الـ PCR المصنوعة ببادئات عادية لا تملكها.