كيف تصمم بادئات qPCR

بمَ تختلف عن بادئات PCR

يقيس qPCR سرعة تراكم الناتج، دورة بعد دورة، فيجب أن تنسخ البادئات هدفها بكفاءة قريبة من 100% وأن تعطي ناتجًا واحدًا. يتطلب ذلك نواتج مضخمة قصيرة وقواعد أشد مما في PCR الاستنساخ، حيث تكفي أي كمية من الحزمة الصحيحة. القواعد العامة في كيف تصمم بادئات PCR وتتحقق منها؛ وهنا القواعد التي تتغير في qPCR.

القواعد

• الناتج المضخَّم: من نحو 70 إلى 150 bp. الناتج القصير يُنسخ كاملًا في كل دورة، فتبقى الكفاءة عالية.
• طول البادئة: من 18 إلى 25 قاعدة.
• Tm: من نحو 58 إلى 62 °C، مع فرق لا يتجاوز 1 أو 2 °C بين البادئتين، محسوبة بالأملاح والمغنيسيوم في المزيج الرئيسي لديك.
• محتوى GC: من 40% إلى 60%، مع ما لا يزيد على 3 من G أو C في آخر 5 قواعد عند الطرف ′3.
• تجنّب: سلاسل من 4 قواعد متماثلة أو أكثر، خاصة من G، والمقاطع التي تتزاوج مع البادئة نفسها أو مع الأخرى. تهم ثنائيات البادئات خاصة مع SYBR Green، الذي يجعل أي DNA مزدوج السلسلة يتوهج، بما في ذلك الثنائيات.

المجسات

مجس التحلل المائي (TaqMan) يرتبط بين البادئتين ويُصمَّم بدرجة Tm أعلى من درجتيهما بـ 5 إلى 10 °C، ليكون مرتبطًا أصلًا حين تبدأ البادئتان بالاستطالة. تجنّب G عند طرفه ′5، بجانب الفلوروفور، لأن G هناك تخمد التألق.

لقياس mRNA: اعبر وصلة إكسون-إكسون

للتعبير الجيني من cDNA، ضع بادئة على وصلة إكسون-إكسون، أو ضع البادئتين في إكسونين مختلفين بينهما إنترون طويل. هكذا لا يعطي DNA الجينومي المتبقي في RNA ناتجًا، أو يعطي ناتجًا أطول من أن يتضخم جيدًا. ويبين ضابط دون RT، أي RNA يمر بالتفاعل دون ناسخ عكسي، إن كان DNA جينومي لا يزال يتسلل.

تحقق من البادئات قبل طلبها

1. احسب درجتي Tm بـ حاسبة Tm للبادئات، بمغنيسيوم المزيج الرئيسي لديك، الذي يكون عادةً 3 mM أو أكثر.
2. ابحث عن الدبابيس والثنائيات الذاتية وطرف ′3 ضعيف أو شديد الالتصاق بـ تحليل بادئات PCR.
3. الصق القالب في نواتج PCR لتتأكد من ناتج واحد بالحجم المتوقع، وابحث عن البادئات في الجينوم كله، مثلًا بأداة NCBI Primer-BLAST، لاستبعاد أهداف أخرى.

تحقق منها في المختبر

حضّر سلسلة تخفيفات من القالب، خمس خطوات أو أكثر بمعامل 10، وارسم Ct مقابل لوغاريتم الكمية بـ حاسبة المنحنى القياسي. يعطي الميل الكفاءة: E = 10^{−1/الميل} − 1. الميل −3.32 يعني 100%، والمجال من 90% إلى 110% مقبول عمومًا. ومع SYBR Green، منحنى انصهار بقمة واحدة حادة يدل على ناتج واحد، ويجب أن يبقى الضابط دون قالب مسطحًا. ثم احسب التعبير النسبي بـ حاسبة ΔΔCt، التي تستخدم طريقة Pfaffl حين تختلف كفاءتا زوجي البادئات.