qPCR প্রাইমার সাধারণ PCR প্রাইমার থেকে আলাদা কীভাবে
একটি qPCR মাপে চক্র ধরে ধরে একটি উৎপাদ কত দ্রুত জমে ওঠে, তাই প্রাইমারগুলোকে তাদের লক্ষ্য প্রায় 100% দক্ষতায় নকল করতে হয় আর একটিই উৎপাদ বানাতে হয়। তার জন্য লাগে ছোট অ্যামপ্লিকন আর একটি ক্লোনিং PCR-এর চেয়ে কড়া নিয়ম, যেখানে ঠিক ব্যান্ডটি যত পরিমাণেই হোক তাতেই চলে। সাধারণ নিয়মগুলো আছে PCR প্রাইমার কীভাবে নকশা করবেন-এ; এখানে কেবল qPCR-এ যেগুলো বদলায় তাই।
নিয়মগুলো
- অ্যামপ্লিকন: প্রায় 70 থেকে 150 bp। ছোট একটি উৎপাদ প্রতিটি চক্রেই পুরোপুরি নকল হয়, যা দক্ষতা উঁচু রাখে।
- প্রাইমারের দৈর্ঘ্য: 18 থেকে 25 বেস।
- Tm: প্রায় 58 থেকে 62 °C, দুটি প্রাইমার একে অন্যের 1 থেকে 2 °C-এর ভেতরে, আর তা আপনার মাস্টার মিক্সের লবণ ও ম্যাগনেশিয়াম ধরে বের করা।
- GC-র পরিমাণ: 40% থেকে 60%, আর 3′ প্রান্তের শেষ 5 বেসে 3-র বেশি G বা C নয়।
- এড়িয়ে চলুন: একই বেসের একটানা 4 বা তার বেশি, বিশেষ করে G, আর এমন টান যা প্রাইমারটির নিজের সঙ্গে কিংবা অন্য প্রাইমারের সঙ্গে জোড়া বাঁধে। প্রাইমার ডাইমারে সবচেয়ে বেশি এসে যায় SYBR Green-এ, যা দুই-সূত্রক যেকোনো DNA-ই জ্বালিয়ে দেয়, ডাইমারসহ।
প্রোব
একটি হাইড্রোলাইসিস (TaqMan) প্রোব দুটি প্রাইমারের মাঝে জুড়ে বসে আর তার Tm তাদের চেয়ে প্রায় 5 থেকে 10 °C ওপরে রেখে নকশা করা হয়, যাতে প্রাইমারগুলো বাড়তে শুরু করার আগেই তা জুড়ে বসে থাকে। তার 5′ প্রান্তে, রিপোর্টার রঙের পাশে একটি G এড়িয়ে চলুন, কারণ ওখানে একটি G প্রতিপ্রভা নিভিয়ে দেয়।
mRNA মাপা: একটি এক্সন-জোড় পেরিয়ে বসান
cDNA থেকে জিনের প্রকাশ মাপতে একটি প্রাইমার একটি এক্সন–এক্সন জোড় পেরিয়ে বসান, কিংবা দুটি প্রাইমার আলাদা এক্সনে রাখুন আর মাঝে একটি লম্বা ইন্ট্রন থাকুক। তখন RNA-তে পড়ে থাকা জিনোমিক DNA কোনো উৎপাদই দেয় না, কিংবা এমন একটি দেয় যা ভালোভাবে বর্ধিত হওয়ার মতো বড় বেশি লম্বা। একটি no-RT নিয়ন্ত্রণ — যে RNA রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ ছাড়াই বিক্রিয়াটি পেরিয়েছে — দেখিয়ে দেয় কোনো জিনোমিক DNA এখনো পার হয়ে যাচ্ছে কি না।
ফরমাশ দেওয়ার আগে প্রাইমার পরখ করুন
- প্রাইমারের Tm-র হিসাব দিয়ে দুটি Tm-ই বের করুন, আর আপনার মাস্টার মিক্সের ম্যাগনেশিয়ামই ব্যবহার করুন, যা প্রায়ই 3 mM বা তার বেশি।
- PCR প্রাইমারের পরিসংখ্যান দিয়ে হেয়ারপিন, স্ব-ডাইমার আর দুর্বল কিংবা আঠালো একটি 3′ প্রান্ত খুঁজে দেখুন।
- টেমপ্লেটটি PCR উৎপাদ-এ সেঁটে দিয়ে আশা করা মাপের একটিই উৎপাদ হচ্ছে কি না তা নিশ্চিত করুন, আর অন্য কোনো লক্ষ্য বাদ দিতে প্রাইমারগুলো পুরো জিনোমের বিপরীতে খুঁজুন, যেমন NCBI Primer-BLAST দিয়ে।
গবেষণাগারে সেগুলো পরখ করুন
টেমপ্লেটের একটি লঘুকরণের ধারা চালান, পাঁচ বা তার বেশি 10 গুণের ধাপে, আর আদর্শ বাঁকের হিসাব দিয়ে পরিমাণের লগের বিপরীতে Ct আঁকুন। ঢালটিই দক্ষতা দেয়: E = 10−1/ঢাল − 1। −3.32 ঢাল মানে 100%, আর 90% থেকে 110% সাধারণত মেনে নেওয়া হয়। SYBR Green-এ একটিমাত্র তীক্ষ্ণ চূড়ার একটি গলনের বাঁক দেখায় উৎপাদ একটিই, আর টেমপ্লেট-ছাড়া নিয়ন্ত্রণটি সমানই থাকা উচিত। তারপর ΔΔCt-র হিসাব দিয়ে আপেক্ষিক প্রকাশ বের করুন, যা দুটি প্রাইমার-জোড়ার দক্ষতা আলাদা হলে Pfaffl উপায়ই ব্যবহার করে।