প্রোটিন 280 nm-এ শোষণ করে কেন
ট্রিপ্টোফ্যান আর টাইরোসিন 280 nm-এ অতিবেগুনি আলো শোষণ করে, আর ডাইসালফাইড বন্ধন একটু জুড়ে দেয়। প্রোটিনে প্রোটিনে প্রত্যেকটির পরিমাণ আলাদা হওয়ায় প্রতিটি প্রোটিনের নিজের একটি নির্বাপণ গুণাঙ্ক আছে, আর A280-র পাঠ আপনি যে গুণাঙ্ক ব্যবহার করছেন তার চেয়ে ভালো হতে পারে না।
সূত্রটি
বিয়ার-লামবার্ট সূত্র থেকে ঘনমাত্রা (M) = A280 ÷ (ε × পথের দৈর্ঘ্য), যেখানে ε হলো M−1 cm−1-এ মোলার নির্বাপণ গুণাঙ্ক। mg/mL পেতে আণবিক ভর দিয়ে গুণ করুন। একটি সহজ পথ হলো Abs 0.1%, অর্থাৎ একটি 1 mg/mL দ্রবণের শোষণ, যা ε ÷ আণবিক ভর: mg/mL = A280 ÷ Abs 0.1%।
ধারা থেকে নির্বাপণ গুণাঙ্ক পাওয়া
পেস আর তাঁর সঙ্গীদের (1995) উপায়টি শোষণ করা অবশেষগুলো গোনে:
ε = 5,500 × Trp + 1,490 × Tyr + 125 × সিস্টিন
একটি সিস্টিন হলো একটি ডাইসালফাইড বন্ধনে জোড়া দুটি সিস্টেইন; একটি বিজারিত প্রোটিনের জন্য ওই পদটি বাদ দিন।
একটি কষে দেখানো উদাহরণ
গরুর সিরাম অ্যালবুমিনের ε = 43,824 M−1 cm−1 আর আণবিক ভর 66,430 Da, তাই তার Abs 0.1% হলো 43,824 ÷ 66,430 = 0.66। একটি 1 cm কিউভেটে 0.33-র একটি পাঠ মানে 0.33 ÷ 0.66 = 0.5 mg/mL, অর্থাৎ 7.5 µM।
ফাঁদ
- প্রোটিনটি যে বাফারে আছে সেই বাফার দিয়েই ব্ল্যাংক করুন; ইমিডাজল, ডিটারজেন্ট আর কিছু বিজারক 280 nm-এ শোষণ করে।
- নিউক্লিক অ্যাসিডের ভেজাল A280 বাড়িয়ে দেয়। একটি শুদ্ধ প্রোটিনের A260/A280 অনুপাত 0.6-র কাছাকাছি; 1-র কাছে বা তার ওপরে মান DNA বা RNA-র ইশারা দেয়।
- পুঞ্জ আলো ছড়িয়ে দেয় আর পাঠ বেশি আসে। ঘোলা নমুনা ঘুরিয়ে নিন কিংবা ছেঁকে নিন।
- পাঠ প্রায় 0.1 আর 1.0-র মধ্যে রাখুন, দরকার হলে লঘু করে।
- ট্রিপ্টোফ্যান কিংবা টাইরোসিন নেই এমন প্রোটিন এভাবে মাপা যায় না; একটি ব্র্যাডফোর্ড কিংবা BCA পরখ নিন।
হিসাব
প্রোটিনের ঘনমাত্রার হিসাব (A280) সেঁটে দেওয়া একটি ধারা থেকে নির্বাপণ গুণাঙ্ক বের করে, কিংবা একটি জানা গুণাঙ্ক বা Abs 0.1% নেয়, আর mg/mL ও µM দেয়। বিয়ার-লামবার্ট সূত্রের হিসাব সাধারণ সমীকরণটি কষে দেয়, আর প্রোটিনের আণবিক ভর একটি ধারা থেকে ভরটি দেয়।