সূত্রটি
জীবিত থাকার হার (%) = জীবিত কোষ ÷ (জীবিত কোষ + মরা কোষ) × 100
জীবিত আর মরা কোষ একই চৌকোগুলোতেই গুনুন, যাতে লঘুকরণ আর কুঠুরির আয়তন কেটে যায়; জীবিত থাকার হার একটি অনুপাত আর তাকে প্রতি mL-এ কোষে বদলানোর দরকার নেই।
ট্রিপ্যান ব্লু কীভাবে কাজ করে
ট্রিপ্যান ব্লু একটি অটুট কোষের পর্দা পেরোতে পারে না। জীবিত কোষ তা বাদ দেয় আর অণুবীক্ষণের নিচে উজ্জ্বলই থাকে; ক্ষতিগ্রস্ত পর্দাওয়ালা মরা কোষ তা টেনে নেয় আর নীল হয়ে যায়। কোষ আর 0.4% ট্রিপ্যান ব্লু 1:1 মিশিয়ে কয়েক মিনিটের বেশি নয় অপেক্ষা করে গুনে নিন: রংটি বিষাক্ত, আর প্রায় 5 মিনিট পরে জীবিত কোষেও রং ধরতে শুরু করে, যা জীবিত থাকার হারকে সত্যির চেয়ে খারাপ দেখায়।
একটি কষে দেখানো উদাহরণ
চারটি বড় চৌকো জীবিতের গোনা দেয় 58, 62, 55 আর 61 (গড় 59) আর মরার গোনা 6, 8, 5 আর 9 (গড় 7)।
- জীবিত থাকার হার = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = 89%।
- প্রতি mL-এ জীবিত কোষ = 59 × 2 (ট্রিপ্যান ব্লুর লঘুকরণ) × 104 = 1.18 × 106।
কতটা বসাবেন তা বের করার সময় মোট নয়, জীবিতের গোনাটিই নিন।
কোনটি মেনে নেওয়ার মতো
লগ দশায় সুস্থ চাষ 90%-র ওপরে জীবিত, আর বেশির ভাগ পরীক্ষাতেই অন্তত 85 থেকে 90% চাই। সদ্য গলানো কোষ 60 থেকে 80% হতে পারে আর একটি পাসের পরে সামলে ওঠে। ট্রিপসিন দিয়ে ছাড়িয়ে নেওয়া কোষ কয়েক শতাংশ হারায়; যে কোষ ট্রিপসিনে বেশি সময় পড়ে থাকে, রুক্ষভাবে পিপেট করা হয় কিংবা এক ঘণ্টা বরফে রাখা হয়, তা আরও বেশি হারায়। পাসে পাসে জীবিত থাকার হার নেমে যাওয়া ভেজাল, খরচ হয়ে যাওয়া মাধ্যম কিংবা ইনকিউবেটরে একটি সমস্যার আগেভাগের ইশারা।
চেনা ভুল
- ভাঙা টুকরো আর রং-লাগা অংশকে মরা কোষ হিসেবে গুনলে সংখ্যাটি নেমে যায়; নিভু, ফোলা কোষকে জীবিত গুনলে তা বেড়ে যায়।
- মরা কোষ চাষের ভেতরে ফেটে মিলিয়ে যায়, তাই একটি জীবিত থাকার গোনা কেবল সাম্প্রতিক মরা দেখায়, যা যা মরেছে তার সবটা নয়।
- ট্রিপ্যান ব্লু গোড়ার অ্যাপোপটোসিসে থাকা কোষ ধরতে পারে না, কারণ তারা তখনো রংটি বাদ দেয়; তাতে এসে গেলে অ্যানেক্সিন V কিংবা প্রোপিডিয়াম আয়োডাইডের মতো একটি রং ফ্লো সাইটোমেট্রির সঙ্গে ব্যবহার করুন।
হিসাব
হিমোসাইটোমিটারের হিসাব জীবিত আর মরার গোনা নেয় আর জীবিত থাকার হার ও প্রতি mL-এ জীবিত কোষ দেয়। কোষ বসানোর হিসাব কতটা পিপেট করবেন তা বের করে, আর কোষের দ্বিগুণ হওয়ার সময়ের হিসাব পাসে পাসে বাড়া নজরে রাখে।