A260 থেকে DNA-র ঘনমাত্রা কীভাবে বের করবেন

শোষণ থেকে ঘনমাত্রায়

নিউক্লিক অ্যাসিড 260 nm-এ অতিবেগুনি আলো শোষণ করে। 1 cm পথে 1.0-র একটি A260 মোটামুটি বোঝায়:

• দুই-সূত্রক DNA-র 50 ng/µL
• RNA-র 40 ng/µL
• এক-সূত্রক DNA-র 33 ng/µL

ঘনমাত্রা = A260 × গুণক × লঘুকরণ। 1:10 লঘু করা একটি নমুনা 0.25 পড়লে তাতে আছে 0.25 × 50 × 10 = dsDNA-র 125 ng/µL। পাঠ সবচেয়ে ভরসার যোগ্য প্রায় 0.1 থেকে 1.0-র মধ্যে; তার চেয়ে ঘন নমুনা লঘু করে নিন। ছোট অলিগো তাদের বেসের গড়ন ধরে বেশি হেরফের করে, তাই সেগুলো তাদের নিজের নির্বাপণ গুণাঙ্ক থেকেই ভালো বের করা হয়।

শুদ্ধতার অনুপাত

• A260/280 DNA-র জন্য 1.8-র কাছাকাছি আর RNA-র জন্য 2.0। তার চেয়ে কম মান প্রোটিন বা ফেনল থাকার ইশারা দেয়।
• A260/230 প্রায় 2.0 থেকে 2.2। তার চেয়ে কম মান গুয়ানিডিন লবণ, EDTA কিংবা তৈরির সময় পড়ে থাকা শর্করার ইশারা দেয়।

ng থেকে অনুলিপিতে

qPCR-র আদর্শের জন্য অণুর সংখ্যা দরকার। dsDNA-র একটি বেস জোড়ার ওজন প্রায় 618 g/mol, তাই একটি 3,000 bp প্লাজমিডের 1 ng মানে প্রায় 3.2 × 10⁸ অনুলিপি।

হিসাব

DNA-র ঘনমাত্রার হিসাব আপনার পাঠ আর লঘুকরণ নেয় আর অনুপাতগুলো মিলিয়ে দেখে। DNA-র অনুলিপি সংখ্যার হিসাব ng আর অনুলিপির মধ্যে বদলে দেয়। অন্য অণুর জন্য বিয়ার-লামবার্ট সূত্রের হিসাব নির্বাপণ গুণাঙ্ক থেকে কাজ করে।

অনুলিপি সংখ্যা কষে দেখানো

অনুলিপি = গ্রামে ভর × 6.022 × 10²³ ÷ (bp-তে দৈর্ঘ্য × 618)। একটি 3,000 bp প্লাজমিডের 1 ng-এ: 1 × 10⁻⁹ × 6.022 × 10²³ ÷ (3,000 × 618) = 6.022 × 10¹⁴ ÷ 1,854,000 = 3.25 × 10⁸ অনুলিপি। কিছু পদ্ধতি প্রতি বেস জোড়ায় 650 g/mol ব্যবহার করে, যা প্রায় 5% কম দেয়।

একটি বাঁধা পরিমাণ পিপেট করা

একটি 125 ng/µL স্টক থেকে একটি বিক্রিয়ায় 100 ng দিতে আপনার দরকার 100 ÷ 125 = 0.8 µL, যা নিখুঁতভাবে পিপেট করার মতো বেশি ছোট। আগে স্টকটি 1:10 লঘু করে 12.5 ng/µL করে নিন আর বদলে 8 µL দিন।

চেনা সমস্যা

• DNA-র পাঠ বেশি বড়। RNA-ও 260 nm-এ শোষণ করে, তাই RNA-ওয়ালা একটি DNA-র তৈরির পাঠ বেশি আসে। RNase দিয়ে চিকিৎসা করুন, কিংবা এমন একটি রং-ভিত্তিক পরখ নিন যা কেবল DNA-ই দেখে।
• পরিষ্কার DNA-তেও 260/280 অনুপাত কম। বাফার-ছাড়া পানি একটু অ্যাসিডীয় আর তা অনুপাতটি 0.2 থেকে 0.3 নামিয়ে দিতে পারে। TE-র মতো একটি বাফারে লঘু করে আর ব্ল্যাংক করে নিন।
• ফোঁটায় ফোঁটায় পাঠ লাফিয়ে যায়। মাপার আগে নমুনাটি মিশিয়ে নিন, দুটি বেদিই মুছে নিন, আর অল্প-আয়তনের যন্ত্রে বুদবুদের দিকে চোখ রাখুন।
• একটি ঋণাত্মক কিংবা খুদে পাঠ। ব্ল্যাংকটি নমুনার চেয়ে আলাদা একটি বাফার ব্যবহার করেছে, কিংবা নমুনাটি যন্ত্রটির কাজের পরিসরের নিচে।