Tm মানে কী
গলনের তাপমাত্রা (Tm) হলো সেই তাপমাত্রা, যেখানে প্রাইমারের অর্ধেক তার লক্ষ্যের সঙ্গে বাঁধা আর অর্ধেক মুক্ত। একটি PCR-র জোড়া বাঁধার ধাপ তার একটু নিচেই বসানো হয়, যাতে প্রাইমার শক্তভাবে জোড়া বাঁধে কিন্তু কেবল ঠিক জায়গাতেই।
তা বের করার তিনটি পথ
- ওয়ালেসের নিয়ম, প্রায় 14 বেসের নিচের প্রাইমারের জন্য: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C)। চটজলদি, তবে তা বেসের ক্রম আর বাফার ধরে না।
- GC সূত্র, লম্বা প্রাইমারের জন্য: Tm = 64.9 + 41 × (G + C − 16.4) ÷ দৈর্ঘ্য। 10টি G বা C-ওয়ালা একটি 20-মার দেয় 64.9 + 41 × (10 − 16.4) ÷ 20 = 51.8 °C।
- নিকটতম-প্রতিবেশীর তাপগতিবিদ্যা, সবচেয়ে নিখুঁত: তা পাশাপাশি বসা প্রতিটি বেস-জোড়ার থাক-বাঁধা শক্তি যোগ করে, তারপর প্রাইমারের ঘনত্ব আর বিক্রিয়ার লবণ ধরে শোধন করে।
বাফারে এসে যায় কেন
ক্যাটায়ন DNA-র কাঠামোর ঋণাত্মক আধান ঢেকে দেয়, তাই বেশি লবণ মানে বেশি Tm। সোডিয়ামের চেয়ে ম্যাগনেশিয়ামের প্রভাব অনেক বেশি, আর dNTP তার কিছুটা বেঁধে রাখে। আলাদা বাফার ধরে নেওয়া হিসাবের মধ্যে একই প্রাইমারে 5 °C বা তার বেশি তফাত হতে পারে, তাই আপনার নিজের মিক্সের সোডিয়াম, ম্যাগনেশিয়াম আর dNTP-র ঘনত্বই বসান।
জোড়া বাঁধার তাপমাত্রা বাছা
জোড়ার কম Tm-র প্রায় 5 °C নিচে শুরু করুন। কোনো উৎপাদ না দেখলে তা নামিয়ে দিন; বাড়তি ব্যান্ড দেখলে বাড়িয়ে দিন। একটি গ্রেডিয়েন্ট PCR এক চালেই একটি পরিসর পরখ করে নেয়। কিছু উঁচু-বিশ্বস্ততার পলিমারেজের সঙ্গে তাদের বানানেওয়ালার নিজের বাফারের নিয়ম আসে, যা একটি আলাদা শুরুর বিন্দু দিতে পারে।
প্রাইমার নকশার মোটা দাগের নিয়ম
- 18 থেকে 25 বেস লম্বা, 40% থেকে 60% GC নিয়ে।
- দুটি প্রাইমারের Tm একে অন্যের প্রায় 5 °C-এর ভেতরে।
- 3' প্রান্তে একটি G বা C, তবে শেষ 5 বেসে 3-র বেশি G বা C নয়।
- একটি বেসের একটানা 4 বা তার বেশি নয়, আর যে টান নিজের সঙ্গে কিংবা অন্য প্রাইমারের সঙ্গে জোড়া বাঁধে তাও নয়।
হিসাব
প্রাইমারের Tm-র হিসাব আপনার লবণ, ম্যাগনেশিয়াম আর প্রাইমারের ঘনত্ব নিয়ে নিকটতম-প্রতিবেশীর তাপগতিবিদ্যা ব্যবহার করে, আর একটি জোড়া বাঁধার তাপমাত্রার পরামর্শ দেয়। PCR প্রাইমারের পরিসংখ্যান তিনটি উপায়ই মিলিয়ে দেখে আর হেয়ারপিন, স্ব-ডাইমার ও একটানা টান নিয়ে সতর্ক করে।