একটি PCR মাস্টার মিক্স কীভাবে বানাবেন

একটি মাস্টার মিক্স কেন

প্রতিটি নলে প্রতিটি উপাদান পিপেট করা ধীর আর প্রতিবারই একটু ভুল জোড়ে। একটি মাস্টার মিক্স বিক্রিয়াগুলো যা ভাগ করে নেয় তার সবই একটি নলে মিশিয়ে দেয়, আর তারপর টেমপ্লেট ঢোকার আগেই তা নলগুলোয় ভাগ করা হয়। প্রতিটি বিক্রিয়াই একই মিশেল পায়, আর আপনাকে অনেক কম ছোট আয়তন পিপেট করতে হয়।

চলতি শেষ ঘনমাত্রা

• বাফার: 1× (একটি 10× কিংবা 5× স্টক থেকে)।
• dNTP: প্রত্যেকটি 0.2 mM।
• MgCl₂: 1.5 থেকে 2.5 mM, যদি বাফারে আগেই তা না থাকে।
• প্রাইমার: প্রত্যেকটি 0.1 থেকে 0.5 µM।
• Taq পলিমারেজ: 50 µL বিক্রিয়ায় প্রায় 1.25 একক।
• টেমপ্লেট: 1 pg থেকে 100 ng, তার উৎস ধরে।

যেখানে আলাদা, সেখানে আপনার পলিমারেজের বইটিই মেনে চলুন; বিশেষ করে উঁচু-বিশ্বস্ততার এনজাইমের নিজেদের পরামর্শ আছে।

আয়তন বের করা

প্রতিটি উপাদানের জন্য প্রতি বিক্রিয়ায় আয়তন = শেষ ঘনমাত্রা ÷ স্টকের ঘনমাত্রা × বিক্রিয়ার আয়তন। একটি 25 µL বিক্রিয়ায় 10× বাফারে লাগে 2.5 µL আর 0.5 µM-এ 10 µM প্রাইমারে লাগে প্রত্যেকটিতে 1.25 µL। টেমপ্লেটের পরে বাকি আয়তনটি পানি ভরে দেয়।

প্রতিটি আয়তনকে বিক্রিয়ার সংখ্যা আর তার সঙ্গে প্রায় 10% বাড়তি দিয়ে গুণ করুন, কারণ ডগা আর নলের দেয়ালে কিছু তরল হারিয়ে যায়। 10টি বিক্রিয়ার জন্য 11-র মতো বানান।

গড়ে তোলা

1. উপাদানগুলো বরফে গলিয়ে নিন, তারপর সেগুলো ভর্টেক্স করে অল্প সময় ঘুরিয়ে নিন (তবে পলিমারেজটি নয়)।
2. আগে পানি দিন, তারপর বাফার, dNTP, MgCl₂ আর প্রাইমার।
3. পলিমারেজটি সবার শেষে দিন, পিপেট করে কিংবা টুসকি দিয়ে নরমভাবে মিশিয়ে নিন, আর ঘুরিয়ে নামিয়ে নিন।
4. মিশেলটি নলগুলোয় ভাগ করুন, তারপর প্রতিটি টেমপ্লেট জুড়ে দিন। টেমপ্লেটের বদলে পানি দিয়ে একটি টেমপ্লেট-ছাড়া নিয়ন্ত্রণ রাখুন।

হিসাব

PCR মাস্টার মিক্সের হিসাব যেকোনো সংখ্যক বিক্রিয়ার জন্য প্রতিটি আয়তন বের করে দেয়। আপনার প্রাইমারের জোড়া বাঁধার তাপমাত্রা দেখে নিন প্রাইমারের Tm-র হিসাব দিয়ে, আর প্রাইমারের স্টক বানান অলিগো গুলিয়ে নেওয়ার হিসাব দিয়ে।