من الامتصاصية إلى التركيز
تمتص الأحماض النووية الضوء فوق البنفسجي عند 260 nm. مع مسار ضوئي طوله 1 cm، تقابل A260 بقيمة 1.0 تقريبًا:
- 50 ng/µL من DNA مزدوج السلسلة
- 40 ng/µL من RNA
- 33 ng/µL من DNA أحادي السلسلة
التركيز = A260 × المعامل × التخفيف. عينة مخففة 1:10 تعطي 0.25 تحتوي 0.25 × 50 × 10 = 125 ng/µL من DNA مزدوج السلسلة. القراءات أكثر موثوقية بين 0.1 و1.0 تقريبًا؛ خفّف العينات الأكثر تركيزًا. قليلات النيوكليوتيد القصيرة تتفاوت أكثر حسب تركيب قواعدها، فالأفضل حسابها بمعامل انطفائها الخاص.
نسب النقاوة
- A260/280 نحو 1.8 لـ DNA و2.0 لـ RNA. القيم الأدنى تشير إلى بروتينات أو فينول.
- A260/230 نحو 2.0 إلى 2.2. القيم الأدنى تشير إلى أملاح الغوانيدين أو EDTA أو كربوهيدرات بقيت من التنقية.
من ng إلى النسخ
لمعايير qPCR تحتاج إلى عدد الجزيئات. يزن زوج القواعد في DNA مزدوج السلسلة نحو 618 g/mol، فـ 1 ng من بلازميد طوله 3000 bp يساوي نحو 3.2 × 108 نسخة.
الحاسبات
تأخذ حاسبة تركيز DNA قراءاتك والتخفيف وتتحقق من النسب. وتحوّل حاسبة عدد نسخ DNA من ng إلى النسخ والعكس. وللجزيئات الأخرى، تعمل حاسبة قانون بير-لامبرت بمعامل الانطفاء.
عدد النسخ خطوة بخطوة
النسخ = الكتلة بالغرامات × 6.022 × 1023 ÷ (الطول بالـ bp × 618). لـ 1 ng من بلازميد طوله 3,000 bp: 1 × 10−9 × 6.022 × 1023 ÷ (3,000 × 618) = 6.022 × 1014 ÷ 1,854,000 = 3.25 × 108 نسخة. وبعض البروتوكولات تستخدم 650 g/mol لكل زوج قواعد، فتعطي أقل بـ 5%.
سحب كمية ثابتة
لوضع 100 ng في تفاعل من مخزون تركيزه 125 ng/µL تحتاج 100 ÷ 125 = 0.8 µL، وهذا أقل من أن يُسحب بدقة. خفف المخزون أولًا 1:10 إلى 12.5 ng/µL وأضف 8 µL.
مشكلات شائعة
- قراءة الـ DNA أعلى من اللازم. يمتص الـ RNA أيضًا عند 260 nm، فتحضير DNA فيه RNA يعطي قراءات عالية. عالجه بـ RNase، أو استخدم اختبارًا بصبغة لا تكشف إلا الـ DNA.
- نسبة 260/280 منخفضة مع DNA نظيف. الماء غير المنظَّم حمضي قليلًا وقد يخفض النسبة بين 0.2 و0.3. خفف واضبط الصفر بمحلول منظم مثل TE.
- القراءات تقفز من قطرة إلى أخرى. اخلط العينة قبل القياس، ونظّف القاعدتين، وانتبه للفقاعات في أجهزة الأحجام الدقيقة.
- قراءة سالبة أو ضئيلة جدًا. ضُبط الصفر بمحلول منظم مختلف عن محلول العينة، أو العينة تحت المدى المفيد للجهاز.