كيف تحسب تغير التعبير في qPCR بطريقة ΔΔCt

ما الذي تحتاجه

قيم Ct لـ جين مستهدف وجين مرجعي (جين تدبير منزلي مثل GAPDH أو ACTB لا يتغير تعبيره مع المعالجة)، مقيسة في عينة معالَجة وعينة ضابطة.

الخطوات الثلاث

1. عايِر كل عينة بالجين المرجعي: ΔCt = Ct المستهدف − Ct المرجعي.
2. قارن المعالَجة بالضابطة: ΔΔCt = ΔCt المعالَجة − ΔCt الضابطة.
3. حوّله إلى تغير في التعبير: التغير = 2^−ΔΔCt.

مثال محلول

المعالَجة: Ct المستهدف 22.1، وCt المرجعي 18.0، فإن ΔCt = 4.1. الضابطة: Ct المستهدف 24.5، وCt المرجعي 18.0، فإن ΔCt = 6.5.

ΔΔCt = 4.1 − 6.5 = −2.4، والتغير = 2^2.4 = 5.3. يُعبَّر عن المستهدف أكثر بنحو 5.3 مرة في العينة المعالَجة. التغير الأقل من 1 يدل على تعبير أقل؛ و0.5 هو النصف.

متى لا تكفي 2^-ΔΔCt

تفترض الطريقة أن لزوجي البادئات كفاءة قريبة من 100%، أي أن الناتج يتضاعف في كل دورة. تحقق من ذلك بمنحنى قياسي؛ والمعتاد بين 90% و110%. إن اختلفت الكفاءتان، فاستخدم طريقة Pfaffl، التي تتضمن كفاءة كل جين: النسبة = E_{المستهدف}^{ΔCt المستهدف} ÷ E_{المرجعي}^{ΔCt المرجعي}، حيث كل ΔCt هو الضابطة ناقص المعالَجة وE = 1 + الكفاءة.

المكررات والإحصاء

• احسب متوسط المكررات التقنية (آبار العينة نفسها) قبل حساب ΔCt.
• أجرِ الإحصاء على قيم ΔCt أو ΔΔCt للمكررات البيولوجية، لا على تغيرات التعبير، لأنها لا تتبع توزيعًا طبيعيًا.
• اذكر log₂ للتغير، وهو ببساطة −ΔΔCt، حين تريد رؤية الزيادات والانخفاضات على المقياس نفسه.

الحاسبة

تحسب حاسبة ΔΔCt متوسط المكررات، وتعطي ΔCt وΔΔCt والتغير في التعبير وlog₂ له، وتنتقل إلى طريقة Pfaffl حين تدخل كفاءات البادئات. وللقياس الكمي المطلق بمنحنى قياسي، تحسب حاسبة عدد نسخ DNA نسخ كل معيار.