كيف تعيد تكوين بروتين أو ببتيد مجفف بالتجميد

الصيغة

الحجم المضاف = الكتلة في القارورة ÷ التركيز المستهدف

اجعل الوحدات متوافقة: mg ÷ mg/mL تعطي mL، وµg ÷ µg/µL تعطي µL.

أمثلة

• 5 mg من ببتيد بتركيز 2 mg/mL: ‏5 ÷ 2 = 2.5 mL.
• 100 µg من جسم مضاد بتركيز 0.5 mg/mL ‏(0.5 µg/µL): ‏100 ÷ 0.5 = 200 µL.
• 1 mg من ببتيد كتلته 1,500 g/mol بتركيز 1 mM: ‏0.001 g ÷ 1,500 g/mol = 0.667 µmol، و0.667 µmol ÷ 1 mmol/L = 667 µL.

تحقق مما في القارورة فعلًا

مسحوق الببتيد المخلّق ليس كله ببتيدًا. الأيونات المضادة مثل ثلاثي فلورو الأسيتات والماء المرتبط تشكل عادةً من 10% إلى 30% من الوزن، فقد تذكر شهادة التحليل محتوى ببتيد صافيًا بنسبة 80% مثلًا. اضرب الكتلة الإجمالية في تلك النسبة قبل الحساب: 5 mg بنسبة 80% تساوي 4 mg من الببتيد. وفي البروتينات، راجع الكمية في ورقة البيانات، وبعد الإذابة أكّد التركيز بالامتصاص عند 280 nm.

اختيار المذيب

• اتبع ورقة البيانات أولًا. معظم البروتينات والأجسام المضادة تُعاد إلى الماء أو إلى المحلول المنظم الذي جُففت منه.
• الببتيدات الغنية بالبقايا القاعدية (K وR وH) تذوب أفضل في قليل من حمض الأسيتيك المخفف؛ والحمضية (D وE) في قليل من بيكربونات الأمونيوم المخففة.
• الببتيدات شديدة الكراهية للماء قد تحتاج أولًا حجمًا صغيرًا من DMSO ثم تخفيفًا بطيئًا في المحلول المنظم. تجنّب DMSO مع الببتيدات التي فيها سيستئين أو ميثيونين، فقد يؤكسدها.

الخطوات

1. اترك القارورة تصل إلى حرارة الغرفة قبل فتحها، كي لا تتكثف الرطوبة على المسحوق.
2. اطردها مركزيًا لحظة ليستقر المسحوق كله في القاع.
3. أضف المذيب ببطء على جدار القارورة.
4. رجّها برفق أو دحرجها واتركها من 15 إلى 30 دقيقة. لا تضع البروتينات في الخلاط الدوامي بقوة: فقد تتمسخ وتكوّن رغوة.
5. إن بقيت عكرة، فقد يساعد حمام فوق صوتي قصير مع الببتيدات. والجسيمات المتبقية غير ذائبة: اطردها مركزيًا وقِس تركيز الطافي.

الحفظ

وزّع المحلول في حصص للاستخدام مرة واحدة وجمّدها عند −20 °C أو −80 °C، لأن كل دورة تجميد وإذابة قد تُفقد بعض النشاط. والبروتينات المخففة تحت نحو 0.1 mg/mL تلتصق بجدران الأنبوب؛ وبروتين حامل مثل BSA ‏0.1% يمنع ذلك حين لا يتداخل مع التجربة.

الحاسبات

تعطي حاسبة إعادة الحل الحجم لتركيز مستهدف، أو التركيز من حجم، بوحدات الكتلة أو المولارية. تحقق من النتيجة بـ حاسبة تركيز البروتين (A280)، وخطط لتخفيفات العمل بـ حاسبة المحاليل الأصلية.