ما معنى Tm
درجة حرارة الانصهار (Tm) هي الدرجة التي يكون عندها نصف البادئة مرتبطًا بهدفه والنصف الآخر حرًا. يُضبط التلدين في PCR أدنى منها قليلًا، لترتبط البادئات بثبات لكن بالموقع الصحيح فقط.
ثلاث طرق لحسابها
- قاعدة Wallace، للبادئات الأقصر من نحو 14 قاعدة: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). سريعة، لكنها تتجاهل ترتيب القواعد والمحلول المنظِّم.
- صيغة GC، للبادئات الأطول: Tm = 64.9 + 41 × (G + C − 16.4) ÷ الطول. بادئة من 20 قاعدة فيها 10 من G أو C تعطي 64.9 + 41 × (10 − 16.4) ÷ 20 = 51.8 °C.
- ديناميكا الجار الأقرب الحرارية، الأدق: تجمع طاقة التراص لكل زوج من القواعد المتجاورة وتصحح حسب تركيز البادئة والملح في التفاعل.
لماذا يهم المحلول المنظِّم
الكاتيونات تعادل الشحنة السالبة لهيكل DNA، فالمزيد من الملح يعني Tm أعلى. للمغنيسيوم أثر أكبر بكثير من الصوديوم، وتلتقط dNTP جزءًا منه. قد تختلف البادئة نفسها بـ 5 °C أو أكثر بين حاسبات تفترض محاليل منظِّمة مختلفة، فأدخل تراكيز الصوديوم والمغنيسيوم وdNTP في مزيجك أنت.
كيف تختار درجة حرارة التلدين
ابدأ بنحو 5 °C تحت أدنى Tm في الزوج. إن لم ترَ ناتجًا، فاخفضها؛ وإن رأيت حزمًا زائدة، فارفعها. يختبر PCR المتدرج مدى كاملًا في تشغيل واحد. بعض البوليميرازات عالية الدقة تأتي بقواعد من الشركة المصنعة لمحلولها المنظِّم، قد تعطي نقطة بداية أخرى.
قواعد عملية للتصميم
- من 18 إلى 25 قاعدة، بنسبة GC من 40% إلى 60%.
- درجتا Tm للبادئتين ضمن نحو 5 °C من بعضهما.
- G أو C عند الطرف '3، لكن دون أكثر من 3 من G أو C في آخر 5 قواعد.
- دون سلاسل من 4 قواعد متماثلة أو أكثر ولا مقاطع تتزاوج مع نفسها أو مع البادئة الأخرى.
الحاسبات
تستخدم حاسبة Tm للبادئات ديناميكا الجار الأقرب الحرارية مع تراكيز الملح والمغنيسيوم والبادئة لديك، وتقترح درجة حرارة تلدين. ويقارن تحليل بادئات PCR الطرق الثلاث وينبه إلى الدبابيس والثنائيات الذاتية والسلاسل.