حاسبة Tm للبادئات
كيف تحسب Tm لبادئ
- الصق البادئ الأمامي، والعكسي إن كان لديك، مكتوبين من '5 إلى '3.
- اضبط تراكيز البادئ والصوديوم والمغنيسيوم وdNTP في مزيج PCR الخاص بك.
- تظهر Tm لكل بادئ مع طوله ومحتوى GC فيه والفرق بين الاثنين ودرجة تلدين ابتدائية.
الأسئلة الشائعة
ما الطريقة المستخدمة؟
ديناميكا الجار الأقرب الحرارية بمعاملات SantaLucia (1998). يُحسب المغنيسيوم كصوديوم إضافي، Na⁺ + 120 × √(Mg²⁺ − dNTP)، وفق von Ahsen et al. (2001).
أي درجة تلدين أستخدم؟
نقطة بداية معتادة هي 5 °C تحت أدنى Tm من الاثنتين؛ وPCR متدرج يجد الأفضل. بعض البوليميرازات، مثل عالية الدقة بمحاليلها الخاصة، لها حاسبة وقواعد الشركة المصنعة، وتعطي قيمًا مختلفة.
كم يجب أن تتقارب قيمتا Tm؟
بفارق أقل من نحو 5 °C، ليرتبط البادئان جيدًا عند درجة التلدين نفسها.
لماذا تعطي حاسبات Tm نتائج مختلفة؟
تستخدم طرقًا مختلفة وتفترض تفاعلات مختلفة. قاعدة والاس وصيغة GC لا تأخذان المحلول المنظِّم في الحسبان، وحاسبات الجار الأقرب تختلف في معاملاتها وتصحيح الأملاح وتراكيز البادئ والمغنيسيوم التي تفترضها. فرق بضع درجات بين الحاسبات أمر طبيعي. أدخل هنا تراكيز تفاعلك أنت، وإن قدّم مصنّع بوليميراز حاسبة لمحلوله، فاتبعها مع ذلك الإنزيم.
ما الصيغة البسيطة لـ Tm بادئ؟
قاعدة والاس، Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C)، للبادئات الأقصر من نحو 14 قاعدة، أو Tm = 64.9 + 41 × (G + C − 16.4) ÷ الطول للأطول. لا تأخذ أي منهما ترتيب القواعد ولا المحلول المنظِّم في الحسبان، فقد تخطئان ببضع درجات؛ ونتيجة الجار الأقرب أعلاه تأخذ الاثنين في الحسبان.
ما Tm المناسبة لبادئات qPCR؟
تطلب معظم أدلة qPCR قيمة Tm بين نحو 58 و62 °C، مع فارق أقل من 1 أو 2 °C بين البادئين، وطول من 18 إلى 25 قاعدة، ونسبة GC بين 40% و60%، وأمبليكون من نحو 70 إلى 150 bp. مسبار التحلل المائي (TaqMan) يكون عادةً أعلى من البادئات بـ 5 إلى 10 °C. ضع مغنيسيوم الـ master mix لديك، وهو عادةً 3 mM أو أكثر، أعلى مما في PCR القياسي.